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一、基于菌落特征及生化和血清學的檢測

病灶細菌的分離培養(yǎng)一般分為以下幾步進行：第一步是預增菌，即對細菌進行數量的擴增。第二步是選擇性增菌，目的是提高目標菌的數量。第三步是對平板上肉眼可見的特征性菌落進行確認，并進行革蘭氏染色觀察細菌的形態(tài)；進行各種生化實驗等作出初步地鑒定。不同種類細菌含有發(fā)酵不同糖（醇、苷）類的酶，因而對各種糖（醇、苷）類的代謝能力也有所不同，即使能分解某種糖（醇、苷）類，其代謝產物可因菌種而異。檢查細菌對培養(yǎng)基中所含糖（醇、苷）降解后產酸或產酸產氣的能力，可用以鑒定細菌種類。細菌可產生各種各樣的酶，這些酶可以特異性地分解相關底物，使培養(yǎng)基呈現出某種顏色或在紫外線下發(fā)出熒光，因而，我們只需在培養(yǎng)基內加入人工合成底物，根據菌落的顏色和熒光的情況即可知道是何種細菌。一般情況，人工合成底物由顯色基團和細菌可代謝物質如糖苷類、氨基酸或肽類兩部分組成，通常情況下底物為無色。在特異性酶作用下游離出產色基團并產生熒光或顯示一定顏色，用紫外燈觀察菌落產生的熒光或直接觀察菌落顏色即可對菌種做出鑒定。

二、基于抗原抗體結合的檢測

細菌的內部和表面含有大量的抗原決定簇，因此可以利用抗體抗原的結合原理利用抗體標記細菌，然后用標記酶(如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等)與抗體結合，酶催化的呈色反應可以間接反映細菌的種類和數量。目前，很多重要的病原物均有相應的抗體，如抗HCV、抗HAV、梅毒抗體、抗HIV、優(yōu)生優(yōu)育TORCH系列等。該法具體程序為采用預先包被了的細菌單克隆抗體的微量塑料板，加入增菌液處理的樣品，反應后再加入一定的指示劑，作用完畢后用酶標儀測定OD值來判定結果。因此，要得出可靠的結果，供試樣品首先必須進行預增菌、選擇性增菌，以便提高檢出陽性率。此法除保留抗體、抗原反應的高度特異性外，由于標記酶的酶促反應的放大作用，使測定的靈敏度更高，檢出細菌極限范圍在105-106cfu／ml。

三、基于遺傳物質的鑒定

1、聚合酶鏈式反應法

聚合酶鏈式反應英文簡稱PCR，是近年應用較為廣泛的分子生物學檢測技術，尤其適用于培養(yǎng)困難或傳統(tǒng)的血清學方法不易檢測的病原細菌。該法的原理是：地球上每種生物的遺傳物質是不同的，聚合酶鏈式反應就是擴增生物中的特異性基因片段進而對生物進行鑒定的，例如沙門氏菌就有多個特異性基因，陳洪認為，編碼細胞膜外膜含鐵細胞受體的基因對沙門氏菌診斷有特異性；還有學者認為gyrA基因和rcsC基因之間的插入序列為傷寒沙門菌所特有，對傷寒有診斷意義，可以利用這些特異性的片段制作檢測探針，目前，根據上述基因設計引物用于人體或自然界中細菌的檢測，并形成了試劑盒作為商品銷售。聚合酶鏈式反應需要的條件有引物、模板和四種脫氧核苷酸，反應過程包括高溫變性、低溫退火和延伸三個階段，經25-30個循環(huán)，一個DNA分子就可擴增106以上。該技術由于其具備快速、高度的特異性和敏感性，可不用進行細菌的培養(yǎng)等特點。

2、擴增片段長度多態(tài)性方法

擴增片段長度多態(tài)性簡稱AFLP，是目前廣泛應用的DNA指紋技術之一，AFLP通過PCR擴增基因組限制性酶切片段并進行電泳分析。具體步驟是先用限制性內切酶切割基因組DNA，接頭序列和相鄰的限制性位點序列作為引物結合位點，然后將雙鏈接頭連接到DN段的末端，進行電泳呈現不同的譜帶。由于AFLP可以使某一個體出現特定的DNA譜帶，而在另一個體中可能無此譜帶產生，因此，得到的DN段多態(tài)性可作為一種分子標記指紋，為研究細菌屬乃至株間的親緣關系提供了有效手段。AFLP結合了RFLP和PCR技術特點，具有RFLP技術的可靠性和PCR技術的高效性，但該法不但成本較高，而且需要操作者具備較高的檢驗技術，目前一般醫(yī)院尚難應用。

四、16sRNA鑒定法

不同原核生物的16srRNA古老且同源，既含有保守序列又有可變序列，保守性反映生物物種的親緣關系，為系統(tǒng)發(fā)育提供線索；可變性則揭示生物物種的特征核酸序列，是種屬鑒定的分子基礎，其序列變化與進化距離相對應，在細菌種屬分類鑒定中廣泛應用。Edman等利用16srRNA技術將孢子病菌與其他38種真菌分子進化樹進行比較，證實其為獨立的一屬。我國學者曾用16srRNA作探針，對來自貴州省不同地區(qū)、不同時間的209株傷寒菌進行核糖體分型(RT型)。結果顯示，這些菌株分屬于26個RT型，以RTl和RT2型為優(yōu)勢，提示貴州地區(qū)傷寒存在眾多的克隆群，這可能是貴州省傷寒多年來發(fā)病率一直居高的原因。核糖體分型技術雖然特異性較強，敏感性也較高，不需要特定的儀器，但操作較繁雜，需要較熟練的技術。

五、小結

法大多都需要特殊的儀器設備和具有操作水平熟練的專業(yè)技術人員，實驗成本也較高，所以只在少數大醫(yī)院使用，這些醫(yī)院的實驗設備好，人員素質高的中心實驗室使用。這些技術對于細菌的許多遺傳學和分類學等方面的問題能給予更確定的答案，并通過檢測種屬特異性基因來檢測標本中病原體的存在與否，能自動快速地對樣本進行檢測鑒定。對于臨床病原細菌的鑒定首先要涂片進行革蘭氏染色鏡檢，可以根據染色反應及形態(tài)特征，初步確定細菌的大致類型，對選擇鑒定方法和合適的培養(yǎng)基具有指導意義。如正常無菌部位的標本通過染色鏡檢，只要檢出細菌，即可診斷為感染類型，盡快為臨床提供可靠的診斷依據。傳統(tǒng)病原菌的分離鑒定較費時耗力，檢測靈敏度差，雖然如此仍是臨床醫(yī)學細菌鑒定的主要途徑，也是分子生物鑒定的基礎條件。分子生物學技術不能顯示微細菌的形態(tài)特征和生化特征等生存性以及是否存在感染的過程，反之，細菌的分離培養(yǎng)可以證實其生存性及細菌的形態(tài)特征和代謝產物等，同時病原細菌的分離培養(yǎng)是深入進行臨床研究、藥敏實驗和流行病學的基礎。