一、常用微生物檢測(cè)技術(shù)

1.染色技術(shù)

染色技術(shù)則是對(duì)微生物細(xì)胞進(jìn)行染色后，對(duì)微生物進(jìn)行觀察檢測(cè)的一種技術(shù)，不過由于染色后微生物標(biāo)準(zhǔn)基本是死的，其形態(tài)和結(jié)構(gòu)會(huì)在染色過程中發(fā)生一定變化，無法切實(shí)反應(yīng)出活細(xì)胞的真實(shí)情況，因此通常只作為輔助檢測(cè)手段。在實(shí)際操作中，整個(gè)流程也較為繁瑣，染色、脫色都需要嚴(yán)格控制，否則將會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性。

2.分離純化技術(shù)

自然環(huán)境中的微生物通常是雜居混生的，在微生物檢測(cè)中需要對(duì)混生微生物群體進(jìn)行分離純化，以對(duì)純微生物進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)，分離純化技術(shù)常用于菌種鑒定中，分離純化技術(shù)是微生物檢測(cè)的一項(xiàng)重要技術(shù)，是微生物檢測(cè)的重要基礎(chǔ)。

3.其它技術(shù)

在微生物常規(guī)檢測(cè)中，通常對(duì)微生物進(jìn)行形態(tài)結(jié)構(gòu)、培養(yǎng)特性方面的觀察，再利用化學(xué)反應(yīng)來測(cè)定微生物的代謝物，以鑒別一些形態(tài)和其它方面不易區(qū)別的微生物，以更好的進(jìn)行微生物分類鑒定。近年來，在環(huán)境監(jiān)測(cè)中，微生物檢測(cè)技術(shù)運(yùn)用方法較為廣泛，如運(yùn)用細(xì)菌總數(shù)和糞便污染指示菌監(jiān)測(cè)水質(zhì)，運(yùn)用發(fā)光細(xì)菌檢測(cè)環(huán)境有毒物質(zhì)，運(yùn)用水中藻類生長量監(jiān)測(cè)水質(zhì)或物質(zhì)霉性等等，這些方法都已經(jīng)有了較為成熟的操作手段和檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)，具有較強(qiáng)的實(shí)踐價(jià)值。

0引言   酯酶（Esterases，EC3．1．1．X）是一種催化酯鍵水解和合成的酶的總稱，水解時(shí)催化酯鍵產(chǎn)生甘油和脂肪酸；合成時(shí)，把酸的羧基與醇的羥基脫水縮合，產(chǎn)物為酯類及其他香味物質(zhì)．它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物中．動(dòng)物胰臟酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要來源．1834年Eberle在兔胰臟中首次發(fā)現(xiàn)脂肪酶，微生物酯酶則以1935年Kirsh發(fā)現(xiàn)產(chǎn)脂肪酶的草酸青霉（PenicilliumOxalicum）為最早．由于微生物資源豐富，同時(shí)利用微生物發(fā)酵產(chǎn)酶具有便于工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，微生物酯酶得到關(guān)注，并且已經(jīng)廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)、食品釀造、醫(yī)藥化學(xué)、污水處理和生物修復(fù)等領(lǐng)域，又由于酯酶的酶促反應(yīng)具有較高的底物專一性、區(qū)域選擇性或者對(duì)映選擇性，它是合成手性化合物（如手性藥物，農(nóng)藥等）的高效生物催化劑，微生物酯酶已成為研究熱點(diǎn)．   1微生物酯酶的組成及來源   1．1酯酶的組成   酯酶主要包括脂肪酶（Lipase，triacylglycerolhydrolases，EC3．1．1．3）和羧酸酯酶（carboxylesterases，arboxylesterhydrolases，EC3．1．1．1）［1－2］，兩者在生化方面沒有本質(zhì)區(qū)別，只是在底物特異性上，羧酸酯酶傾向于水解酰基鏈長度小的底物（≤10），而脂肪酶傾向于水解酰基鏈長度大的底物（≥10）［3－4］，在結(jié)構(gòu)上，酯酶屬于α／β水解酶超家族，具有Ser－His－Asp構(gòu)成的催化中心三組合（catalytictriad），其中Ser通常位于具有保守的Gly－Xaa－Ser－Xaa－Gly五肽結(jié)構(gòu)內(nèi)［1－2］．細(xì)菌脂肪酶又包括八大家族：truelipase，GDSL，F(xiàn)amilyIII，thehormone－sensitivelipase（HSL），F(xiàn)amilyV－VIII，其中truelipase又包括7個(gè)亞族SubfamilyI．1－I．7［2，5］．阿魏酸酯酶（Ferulicacidesterase，EC．3．1．1．73）又稱為肉桂酸酯酶，是最近分離出一種酯酶，它是羧酸酯水解酶的一個(gè)亞類，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯鍵［6］．   1．2微生物酯酶的來源   在自然界中能產(chǎn)生酯酶的微生物資源是非常豐富的，從分類上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、鏈孢霉、紅曲霉、黑曲霉、黃曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁頭霉、須霉、白地霉和核盤菌等12屬23種；其次是細(xì)菌，在細(xì)菌中主要是芽孢桿菌屬、假單胞菌屬以及伯克霍爾德菌屬等；另外，放線菌中的個(gè)別種類也能產(chǎn)生一定量的酯酶．2產(chǎn)酯酶微生物的篩選及酶活力的測(cè)定一般篩選流程為：樣品→富集培養(yǎng)→平板分離→平板初篩（觀察透明圈）→搖瓶復(fù)篩（測(cè)酶活力大小），三油酸甘油酯是產(chǎn)酯酶微生物初篩加入培養(yǎng)基中的常用底物，因?yàn)槌鹾Y選用平板培養(yǎng)基，而在培養(yǎng)基中存在不互溶的油、水兩相，所以要對(duì)它們先進(jìn)行乳化，乳化劑可選用聚乙烯醇或者吐溫．溴甲酚紫由于反應(yīng)后pH變化顯色，而RhodamineB由于可以和分解后的物質(zhì)結(jié)合形成顯色物質(zhì)，它們被用作常用指示劑加入培養(yǎng)基內(nèi)［7］．對(duì)于酯酶活力的測(cè)定，常見方法有以下幾種：酯酶活力比色法，即以對(duì)硝基苯酚為底物，分光光度計(jì)測(cè)定400nm處吸光度值［7］；酯酶活力滴定法，以NaOH滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下釋放的醋酸來測(cè)定；α－乙酸萘酯比色法，即先繪制α－萘酚標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后在pH10的Tris－HCl緩沖液中，以α－乙酸萘酯為底物和粗酶液反應(yīng)，在595nm處測(cè)其吸光度值［8］．   3微生物酯酶與基因克隆   隨著分子生物學(xué)和宏基因組學(xué)的發(fā)展，越來越多的研究人員從不同環(huán)境樣品中篩選產(chǎn)酯酶微生物，克隆酯酶基因，構(gòu)建高產(chǎn)的基因工程菌為進(jìn)行后續(xù)的工業(yè)化生產(chǎn)打下基礎(chǔ)．其中的環(huán)境樣品的主要來源是土壤以及海洋，特別是海洋環(huán)境樣品，因?yàn)楹Ｑ蟓h(huán)境包括低溫、高溫、高靜水壓、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿以及營養(yǎng)條件極為貧乏的各種極端環(huán)境，微生物要在這樣的環(huán)境中生存，生理結(jié)構(gòu)、代謝方式等都會(huì)發(fā)生一系列改變，所以從海洋中篩選到的微生物可能具備某些特殊的代謝產(chǎn)物，另外低溫酯酶的研究也十分廣泛，近年來已純化或克隆表達(dá)了從南北極、深海、高山凍土中分離到的低溫微生物產(chǎn)生的低溫脂肪酶，如菌株P(guān)seudomonasfragiIFO3458（PFL），Pseudomonassp．KB700A，Pseudomonassp．B11－1，Aeromonassp．LPB4的脂肪酶［9－12］．鄭鴻飛等［13］從青島前海和膠州灣海區(qū)樣品中分離到1株產(chǎn)酯酶活力和穩(wěn)定性較高的菌株EB21；邵鐵娟等［14］從2000多份渤海海區(qū)海泥樣品中分離出一株新型脂肪酶高產(chǎn)菌株BohaiSea－9145，經(jīng)鑒定為適冷性海洋酵母（Yarrowialipolytica）；張金偉等［15］從南極普里茲灣深海沉積物中篩選到一株產(chǎn)低溫脂肪酶的菌株7195；林學(xué)政等［16］從南大洋普里茲灣的水樣中篩選到一株產(chǎn)低溫脂肪酶的深海嗜冷菌25101；JeonJH等［17］從南韓江華島潮汐平原沉淀物宏基因文庫中分離到一種耐鹽的酯酶基因亞型；一個(gè)新的酯酶基因estDL30從沖積土宏基因組文庫中被篩出，它由1524個(gè)核苷酸組成，編碼的蛋白質(zhì)又507個(gè)氨基酸組成，這個(gè)酯酶蛋白屬于familyVII［18］；一個(gè)超表達(dá)的阿魏酸酯酶基因estF27從土壤宏基因組文庫中被篩出［19］．   4微生物酯酶的應(yīng)用   4．1在食品加工方面的應(yīng)用   酯酶主要通過酯交換［20］、水解［21，22］及合成化合物等方式應(yīng)用于食品加工方面．固定化脂肪酶現(xiàn)在已用于芳香酯的合成，而低分子量芳香酯多呈天然水果味，它們廣泛應(yīng)用于食品、飲料等食品工業(yè)，Melo等［23］研究用Rhizopussp．脂肪酶合成香茅醇芳香酯優(yōu)化條件；利用酯酶使乳制品增香［24］，在釀酒和食用醋的生產(chǎn)中，利用酯酶提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯類的含量，使口感有明顯提高；食用油脂精煉工藝中，借助微生物酯酶在一定條件下能催化脂肪酸與甘油之間的酯化反應(yīng)，從而把油中的大量游離脂肪酸轉(zhuǎn)變成中性甘油酯，提高了食用油的價(jià)值；脂肪酶在面包專用粉中還有面團(tuán)調(diào)理的功能，使面包質(zhì)地柔軟，顏色更白；酯酶催化合成單甘脂［25］是使用量最大的食品乳化劑；阿魏酸是天然抗氧化劑，也是近年來國際認(rèn)知的防癌物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品原料中，目前已使用阿魏酸酯酶與其他酶協(xié)同從各種農(nóng)作物副產(chǎn)品中提取阿魏酸［26］，并且阿魏酸作為合成天然香蘭素的前體，利用微生物方法產(chǎn)生香蘭素，具有毒性低、安全性高的特點(diǎn)，應(yīng)用于食品中．#p#分頁標(biāo)題#e#   4．2在精細(xì)化工中的應(yīng)用   表面活性劑在化妝品、洗滌用品中有重要用途，傳統(tǒng)的化學(xué)生產(chǎn)具有選擇性差、需要高溫等缺點(diǎn)，酶法克服了這些缺點(diǎn)，酯酶催化糖酯等生物表面活性劑的合成，而糖酯是一種重要的生物表面活性劑；酯酶還有提高表面活性劑的釋放［27］的作用；在洗滌劑中添加堿性脂肪酶，可以提高去污力，降低三聚磷酸鈉等的用量，減少污染；酯酶的底物特異性及高度立體專一性可合成具有應(yīng)用價(jià)值的精細(xì)化工產(chǎn)品，如化妝品的長鏈脂肪酸酯等．   4．3在手性化合物中的應(yīng)用   由于酯酶酯化反應(yīng)具有高底物專一性、區(qū)域選擇性、對(duì)映選擇性等優(yōu)點(diǎn)，因此酯酶是有機(jī)合成中重要的生物催化劑，而且催化效率比化學(xué)試劑高出很多．手性化合物是指分子量、分子結(jié)構(gòu)相同，但左右排列相反，如實(shí)體與鏡中的映體的化合物，而醫(yī)藥領(lǐng)域很多藥物都是手性化合物，而近年來酶拆分已經(jīng)成為手性化合物拆分的研究熱點(diǎn)，酯酶又是酶拆分中研究最為廣泛的一種．WENS等［28］考察了實(shí)驗(yàn)室自制的LipaseCAN、LipaseRH兩種酯酶對(duì)α一苯乙胺的拆分效果，并與幾種商品酶做了對(duì)照，結(jié)果表明Novozyme435這種商品酶的拆分效果最好．GodinhoLF等［29］用酯酶高效的對(duì)1，2－O異亞丙基甘油酯進(jìn)行拆分，其中對(duì)映體過量值可達(dá)到72％～94％；研究人員改良不同介質(zhì)中固定化脂肪酶拆分手性化合物，如任夢(mèng)遠(yuǎn)等［30］以自制的平均粒徑為4．5μm磁性高分子微球?yàn)檩d體，采用離子交換法固定化Candidarugosa脂肪酶，催化（±）－薄荷醇的酯化反應(yīng)，所制備的固定化脂肪酶在離子液體［bmin］PF6中催化拆分（±）－薄荷醇的效果最佳，與游離酶相比固定化脂肪酶的立體選擇性有很大的提高，對(duì)映體過量值可達(dá)93％，對(duì)映體選擇值為35．Zheng等［31，32］利用純化后的重組后酯酶（Escherichiacoli．BL21）對(duì)薄荷醇進(jìn)行轉(zhuǎn)酯化拆分，結(jié)果顯示，底物／酶質(zhì)量比S／C≥50條件下，相對(duì)于丙烯酸、正丁酸酯化劑，乙酸酯化劑的效果最好（酯酶對(duì)乙酸薄荷酯的E＞100），且通過回收，固定化酶重復(fù)使用次數(shù)達(dá)4－5次．戴大章等［33］采用改性Ultrastable－Y分子篩固定化P．expansumPED－03脂肪酶（PEL），利用固定化PEL在微水相中對(duì)（R，S）－2－辛醇進(jìn)行拆分，在以正己烷為溶劑，含水量為0．8％的體系中，于50℃反應(yīng)24h的轉(zhuǎn)化率（c）可達(dá)到理論值的97．68％，對(duì)映體過量值（e．e．）可達(dá)到98．75％．對(duì)于手性藥物，是手性化合物中的研究熱點(diǎn)，研究人員利用酯酶對(duì)其進(jìn)行拆分，如（R）－氟比洛芬［34］、酮基布洛芬［35］等，使對(duì)映體過量值得到提高，提高了藥物的有效值．   4．4在環(huán)境治理方面的應(yīng)用   隨著農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中農(nóng)藥的大量使用，農(nóng)藥污染、殘留等問題也日趨嚴(yán)重，而農(nóng)藥中菊酯類殺蟲劑廣泛應(yīng)用于果蔬、果樹、花卉、林木等，由于其自然條件下難以快速降解，農(nóng)藥殘留帶來潛在的食品安全和環(huán)境污染問題．研究表明，菊酯類殺蟲劑具有類固醇結(jié)合活性，可能影響人體激素正常水平［36］．研究人員對(duì)菊酯類殺蟲劑的降解進(jìn)行了大量研究［37，38］，而利用微生物降解農(nóng)藥是一條重要途徑，研究表明從環(huán)境樣品中篩選出的微生物對(duì)擬除蟲菊酯［39］，包括氯氰菊酯［40］、丙烯菊酯［41］等有高效降解作用，隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，許多研究人員已經(jīng)克隆到酯酶基因［42，43］，而利用基因克隆和酯酶的定向化技術(shù)，構(gòu)建產(chǎn)酯酶的高效基因工程菌也已經(jīng)成為環(huán)境保護(hù)的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)．   5展望   近年來，隨著宏基因組文庫、基因工程、定向進(jìn)化技術(shù)、固定化技術(shù)的發(fā)展，以及界面酶促過程等技術(shù)的深入開展，微生物酯酶的研究已經(jīng)進(jìn)行到分子層面，高效產(chǎn)酯酶菌株的篩選、誘變育種、基因克隆及其定向進(jìn)化構(gòu)建高效基因工程菌的研究取得了長足發(fā)展，隨著人們生活水平的提高，食品、醫(yī)藥、化妝品等中的添加天然成分將受到廣泛關(guān)注，特別是天然底物的生物合成和手性化合物的酶拆分，因此，微生物酯酶在食品、醫(yī)藥、精細(xì)化工等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用前景．由于微生物酯酶廣泛的應(yīng)用前景，本實(shí)驗(yàn)室最近從紅樹林土壤樣品中通過宏基因組文庫的方法篩選到一新型低溫耐堿酯酶基因，已經(jīng)提交到Genbank，其登錄號(hào)碼為（JQ701700）．實(shí)驗(yàn)室成員正在進(jìn)行深入研究，酯酶的工業(yè)化生產(chǎn)及其在各領(lǐng)域的應(yīng)用將會(huì)逐步實(shí)現(xiàn)．

傳統(tǒng)的功能微生物鑒定方法是在含有特定碳源培養(yǎng)基上對(duì)目標(biāo)微生物進(jìn)行富集、分離與純化，由于實(shí)驗(yàn)室可培養(yǎng)的微生物只占微生物總數(shù)的0.1~1%[1]，因此以純培養(yǎng)技術(shù)為代表的鑒定方法存在很大局限性。20世紀(jì)后半葉，以分子生物學(xué)為特色的現(xiàn)代土壤微生物研究方法取得突破性進(jìn)展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技術(shù)為代表的生物化學(xué)方法，以BIOLOG技術(shù)為代表的生理學(xué)方法和基于DNA多態(tài)性的微生物群落結(jié)構(gòu)和功能多樣性的分子生態(tài)學(xué)技術(shù)，如變性梯度凝膠電泳（DGGE）、限制性片段長度多態(tài)性（RFLP）、末端限制性酶切片段長度多態(tài)性分析（T-RFLP）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)（RT-PCR）等。上述技術(shù)提高了人們對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)組成的認(rèn)識(shí)，但仍難提供有關(guān)微生物間相互作用及代謝功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指紋圖譜方法只能檢測(cè)環(huán)境樣品中的優(yōu)勢(shì)微生物群落，但具有特定生態(tài)和環(huán)境功能的微生物通常在數(shù)量上并不占優(yōu)勢(shì)[3]。因此，功能微生物很難被這些分子指紋圖譜方法所鑒別[2]。據(jù)估算，每克土壤含有約100億個(gè)微生物個(gè)體，包括100萬種不同的微生物種群。利用上述技術(shù)，從這些難以計(jì)數(shù)的土壤微生物中原位鑒別特定生態(tài)過程的微生物驅(qū)動(dòng)者是難以想象的[4]。近年來得到廣泛關(guān)注的穩(wěn)定性同位素探針技術(shù)與現(xiàn)代分子生物學(xué)相結(jié)合，可以在相對(duì)未受干擾的環(huán)境樣品中培養(yǎng)功能微生物，利用穩(wěn)定性同位素示蹤復(fù)雜環(huán)境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鑒定生態(tài)系統(tǒng)重要過程的微生物驅(qū)動(dòng)者。其基本原理是在土壤中添加含有穩(wěn)定性同位素標(biāo)記的代謝底物，土壤中利用該標(biāo)記底物的微生物細(xì)胞在其生長繁殖過程中同化合成含標(biāo)記元素的生物標(biāo)志物。通過對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行提取、分離、鑒定和比對(duì)分析，鑒別土壤中驅(qū)動(dòng)特定生態(tài)過程的功能微生物。該方法可以準(zhǔn)確獲得功能微生物的目的基因，避免了從浩瀚基因庫里一個(gè)個(gè)篩選目的基因的煩勞工作，已成為原位鑒定功能微生物的重要手段。   1土壤功能微生物SIP鑒定技術(shù)流程   SIP技術(shù)是耦合微生物遺傳多樣性與代謝多樣性最有力的工具之一，該技術(shù)以復(fù)雜的原位或微宇宙土壤樣品為研究對(duì)象，采用穩(wěn)定性同位素原位標(biāo)記土壤樣品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前絕大多數(shù)研究采用13C標(biāo)記底物培養(yǎng)土壤，利用13C-底物的微生物細(xì)胞不斷分裂、生長、繁殖，合成含13C標(biāo)記的DNA或RNA等生物標(biāo)志物。提取土壤樣品中13C-核酸和12C-核酸總混合物，用超高速離心技術(shù)將13C-核酸與12C-核酸分離，利用分子生物學(xué)手段對(duì)生物標(biāo)志物進(jìn)行分析，以鑒別土壤功能微生物。近年來，以15N和18O為基礎(chǔ)的SIP技術(shù)也被成功應(yīng)用于微生物驅(qū)動(dòng)的土壤生態(tài)過程研究[6]。   1.1土壤SIP技術(shù)前處理方法選擇   SIP技術(shù)前處理包括標(biāo)記底物的培養(yǎng)和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取兩個(gè)步驟。培養(yǎng)方式主要包括添加營養(yǎng)液富集培養(yǎng)和僅添加標(biāo)記底物培養(yǎng)等方式。添加營養(yǎng)液富集培養(yǎng)法可以為微生物生長提供相對(duì)穩(wěn)定的環(huán)境，并促進(jìn)微生物的生長，以獲得足夠的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括試劑盒提取法和液氮研磨法等。試劑盒法操作簡(jiǎn)單，提取純度高，但提取量較低，費(fèi)用高。液氮研磨法可以較好保證DNA/RNA的完整性，提取量相對(duì)較高，且操作費(fèi)用低，時(shí)間短，但需純化后才能滿足RT-PCR等后續(xù)分子生物學(xué)要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要為兩種：一種是PLFAs法，即先通過氯仿-甲醇單相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再經(jīng)硅膠柱純化以及酯化作用得到活體細(xì)胞膜結(jié)合態(tài)FAME，提取的脂肪酸種類僅有El-脂肪酸，多為細(xì)菌所特有。另一種是TSFAMEs法，即通過堿甲醇分解法提取總土壤FAMEs。提取的脂肪酸種類包括酯連接和非酯連接PLFAs，多為真菌所特有[9]。   1.2土壤SIP技術(shù)中生物標(biāo)志物的選擇   土壤SIP技術(shù)中特定微生物的生物標(biāo)志物為PLFA、DNA和RNA3種。PLFA-SIP法是將PLFA從重穩(wěn)定性同位素（如13C）標(biāo)記過的環(huán)境樣品中提取出來，通過PLFA圖譜分析微生物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，再通過氣相色譜-燃燒-同位素比率質(zhì)譜聯(lián)用法測(cè)定各種PLFA中13C的豐度[7]。PLFA-SIP的標(biāo)記底物濃度要求較低，靈敏度較高，但存在一些缺點(diǎn)：（1）對(duì)于未知PLFA分子圖式的不可培養(yǎng)微生物，或者土壤中的某種特殊脂肪酸無法與特定種類的微生物相對(duì)應(yīng)，該方法就無法鑒定功能微生物。（2）該方法在很大程度上依賴于標(biāo)記脂肪酸來確定土壤微生物群落結(jié)構(gòu)，標(biāo)記上的變動(dòng)將導(dǎo)致群落估算上的偏差。（3）細(xì)菌和真菌生長條件的改變或環(huán)境脅迫都能導(dǎo)致脂肪酸類型的改變[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可獲得更直接的功能微生物遺傳信息。DNA-SIP的優(yōu)點(diǎn)是：標(biāo)記的13C-DNA一定來自新產(chǎn)生的子代微生物細(xì)胞，是證明微生物原位生長并驅(qū)動(dòng)生態(tài)過程的最直接證據(jù)。另外，DNA完美的雙鏈結(jié)構(gòu)保證了遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定[10]。DNA-SIP的缺點(diǎn)是：自然環(huán)境中能被微生物利用的底物濃度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用較高濃度的標(biāo)記底物來刺激目標(biāo)微生物的分裂繁殖，可能導(dǎo)致研究結(jié)果與原位自然環(huán)境的實(shí)際情況不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺點(diǎn)。自然環(huán)境中特定功能微生物發(fā)揮作用的同時(shí)，即使沒有大量增殖生長，但具功能基因得到表達(dá)并在核糖體內(nèi)合成蛋白質(zhì)，獲得標(biāo)記的13C-RNA則表明微生物可能具有較強(qiáng)的活性。因此，RNA-SIP能夠采用更低的標(biāo)記底物濃度培養(yǎng)環(huán)境樣品，研究結(jié)果更接近原位狀況[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的實(shí)際應(yīng)用仍存在較大的技術(shù)難度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的結(jié)合將會(huì)大大提升SIP技術(shù)的潛力。   1.3土壤SIP分離后的分析方法   13C-核酸與12C-核酸分離后，可以利用分子生物學(xué)手段對(duì)功能微生物的DNA/RNA進(jìn)行分析，以鑒別土壤中重要生態(tài)過程的微生物驅(qū)動(dòng)者。目前的主要分析方法包括分子指紋圖譜法、實(shí)時(shí)定量PCR法和454高通量測(cè)序法等。（1）分子指紋圖譜法是目前進(jìn)行功能微生物的DNA/RNA分析的廣泛使用的快捷方法，但分子指紋圖譜分析方法的靈敏度較低。環(huán)境樣品中微生物通常數(shù)以百萬計(jì)，采用古菌或細(xì)菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能檢測(cè)環(huán)境樣品中數(shù)量上占優(yōu)勢(shì)的微生物[14]。具有較為重要的生態(tài)和環(huán)境功能目標(biāo)微生物通常在數(shù)量上不占優(yōu)勢(shì)。因此，目標(biāo)微生物同化利用13C-底物后發(fā)生的微小變化很難被分子指紋圖譜法所鑒別。（2）實(shí)時(shí)定量PCR法直接針對(duì)目標(biāo)微生物的功能基因，采用高度靈敏的實(shí)時(shí)定量PCR測(cè)定不同密度層級(jí)中目標(biāo)微生物的數(shù)量，顯著提高了SIP技術(shù)的可靠性。然而，采用特異引物定量研究目標(biāo)微生物存在一定難度。土壤中數(shù)量眾多的微生物基因組DNA可能被13C標(biāo)記，很難采用單一的功能基因或16SrRNA基因特異引物，同時(shí)研究眾多目標(biāo)微生物在不同密度層級(jí)中的分布規(guī)律。我們無從得知哪一種微生物可能利用穩(wěn)定性同位素標(biāo)記底物，無法設(shè)計(jì)特異的功能引物，只能通過選擇性定量目標(biāo)微生物，明確目標(biāo)微生物在不同密度層級(jí)中的分布規(guī)律，同時(shí)判定SIP技術(shù)的可靠性[13，15]。（3）454高通量測(cè)序法是通過檢測(cè)各浮力密度層中微生物16SrRNA基因組成，分析目標(biāo)標(biāo)記微生物占該層總微生物的比例，從而鑒別前所未知的重要功能微生物。該技術(shù)可規(guī)避PCR擴(kuò)增，直接對(duì)標(biāo)記13C-RNA測(cè)序，每次分析可獲得大約100萬16SrRNA基因序列，顯著增強(qiáng)了重浮力密度層中13C-標(biāo)記微生物DNA序列的檢測(cè)靈敏度。高通量測(cè)序可全面分析微生物群體的物種、基因功能組成，最大程度地認(rèn)識(shí)未培養(yǎng)微生物的遺傳組成和生命活動(dòng)，是目前最準(zhǔn)確的方法[16]。但該方法目前測(cè)試費(fèi)用較高，后續(xù)數(shù)據(jù)處理復(fù)雜，但隨著技術(shù)發(fā)展必將成為功能基因組學(xué)研究的主流技術(shù)。#p#分頁標(biāo)題#e#   1.4構(gòu)建克隆文庫   超高速密度梯度離心分離并鑒別13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文庫，構(gòu)建遺傳系統(tǒng)發(fā)育樹的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落組成，并比較二者的差別，鑒定被13C底物所標(biāo)記的微生物群落。   2SIP技術(shù)在土壤功能微生物鑒定中的應(yīng)用   目前SIP技術(shù)在土壤分子生態(tài)學(xué)研究領(lǐng)域主要應(yīng)用在原位鑒定介導(dǎo)有機(jī)污染物生物降解和碳氮循環(huán)過程的功能微生物方面。有機(jī)污染物生物降解研究多集中于單環(huán)芳烴、PAHs和PCBs的研究，碳氮循環(huán)研究多集中于植物-微生物相互作用對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)中碳氮轉(zhuǎn)化、土壤中碳氮周轉(zhuǎn)速率、稻田產(chǎn)甲烷機(jī)理及產(chǎn)甲烷菌的研究。   2.1SIP技術(shù)在土壤有機(jī)污染物生物降解研究中應(yīng)用   在有機(jī)污染物生物降解的微生物生態(tài)學(xué)研究中，SIP技術(shù)可以幫助了解在復(fù)雜原位土壤環(huán)境中，參與各個(gè)降解過程和途徑中功能微生物種類。Hanson等首次使用PLFA-SIP技術(shù)研究甲苯的生物降解，總共提取發(fā)現(xiàn)的59種PLFAs中有16種出現(xiàn)13C標(biāo)記[17]。Christopher等在對(duì)農(nóng)田土壤中苯酚降解菌的研究中，對(duì)13C標(biāo)記苯酚的DNA進(jìn)行18S-28S內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)的PCR擴(kuò)增，T-RFLP分析，成功分離出一種白色細(xì)狀的真菌，并證實(shí)該真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技術(shù)對(duì)13C標(biāo)記苯酚的RNA反轉(zhuǎn)錄PCR和T-RFLP分析，新發(fā)現(xiàn)了3種苯酚降解菌。羅春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技術(shù)研究了甲苯、苯和間二甲苯的降解菌，對(duì)分離出的13C-DNA進(jìn)行T-RFLP分析、克隆文庫的構(gòu)建，獲得了相應(yīng)的降解菌，并首次報(bào)道了TM7門對(duì)甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技術(shù)鑒定甲苯退化細(xì)菌，鑒定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地區(qū)的田間試驗(yàn)中，向受試的粉砂壤土供應(yīng)13C標(biāo)記的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通過GC/MS監(jiān)控土壤中釋放的13CO2濃度，以此估測(cè)底物降解速率，并將分離得到13C-DNA用通用引物對(duì)16SrRNA基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，最終得到29個(gè)完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技術(shù)，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6種多環(huán)芳烴功能的微生物群落，將13C作為標(biāo)記元素，構(gòu)建13C-DNA的16SrRNA克隆文庫和RT-PCR分析，結(jié)果表明不可培養(yǎng)菌PG2不僅可以降解芘，還能降解熒蒽和苯并[A]蒽，從而說明PG2菌對(duì)四環(huán)PAHs有著良好的降解效果[6]。Tillmann等設(shè)計(jì)了一個(gè)PLFA-SIP微宇宙實(shí)驗(yàn)，將PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯聯(lián)苯中，采用GC-C-IRMS測(cè)定不同PLFA13C的豐度，結(jié)果表明非優(yōu)勢(shì)菌在PCBs好氧降解過程中的主導(dǎo)作用[25]。Shahid等在對(duì)五氯酚降解菌的研究中，比較了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技術(shù)的鑒定效果，結(jié)果表明RNA-SIP技術(shù)可以更好反映功能微生物群落的變化趨勢(shì)[11]。Sul等將DNA-SIP和宏基因組技術(shù)結(jié)合，對(duì)13C-聯(lián)苯-DNA中芳烴雙加氧酶基因片段PCR擴(kuò)增，得到兩串與bphA相似的序列組，構(gòu)建1568粘粒克隆文庫，發(fā)現(xiàn)除含bphAE基因外，還含有屬于γ-變形菌綱的未知基因片段，該片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平轉(zhuǎn)移而形成的[26]。   2.2SIP技術(shù)在土壤C循環(huán)中的應(yīng)用   土壤C轉(zhuǎn)化是微生物主導(dǎo)的生物地球化學(xué)過程，SIP技術(shù)能夠很好地將微生物群落與其功能聯(lián)系起來，加深人們對(duì)陸地生態(tài)系統(tǒng)重要C循環(huán)過程的認(rèn)識(shí)。Boschker等最先使用PLFA-SIP技術(shù)進(jìn)行甲烷營養(yǎng)菌的研究[7]，隨后，DNA-SIP技術(shù)被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活性功能種群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4對(duì)取自羅馬尼亞MovileCave地下水系統(tǒng)的樣品進(jìn)行短期培養(yǎng)，以DNA-SIP技術(shù)為前提確定了3類含有編碼甲烷單氧化酶基因的甲烷營養(yǎng)菌，并通過與非甲烷營養(yǎng)菌比對(duì)證明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究養(yǎng)分添加對(duì)甲烷營養(yǎng)菌多樣性的影響時(shí)，人工添加養(yǎng)分在一定程度上可避免交叉取食，改進(jìn)了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松樹林土壤中的甲烷營養(yǎng)菌群落結(jié)構(gòu)組成與CH4氧化率的聯(lián)系，并簡(jiǎn)短討論了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英國不同陸地生態(tài)系統(tǒng)土壤中氯化甲烷營養(yǎng)菌的多樣性，通過與培養(yǎng)分離法的結(jié)果比較，揭示出土壤中仍存在大量不可培養(yǎng)的鹵化甲烷營養(yǎng)菌，并將鹵化甲烷的全球循環(huán)同一組目前已知的鹵化甲烷營養(yǎng)菌特征群聯(lián)系了起來[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技術(shù)進(jìn)行甲醇營養(yǎng)菌的研究，通過13CH3OH培養(yǎng)森林土壤，證明被13C標(biāo)記的細(xì)菌16SrRNA基因序列與已知可培養(yǎng)的甲醇營養(yǎng)菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此類細(xì)菌還存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技術(shù)證明了稻田土壤中，甲酸鹽中的C首先被光營養(yǎng)的初級(jí)和次級(jí)生產(chǎn)者利用，隨后產(chǎn)生的有機(jī)物被其他微生物利用[31]。陸雅海等用13CO2對(duì)水稻進(jìn)行脈沖標(biāo)記培養(yǎng)，利用RNA-SIP技術(shù)與T-RFLP分析，獲得水稻根際的產(chǎn)甲烷菌，并通過厭氧和好氧條件的對(duì)比，表明根際環(huán)境和降解過程的多相性[32，13]。該團(tuán)隊(duì)還利用PLFA-SIP描述了水稻根際微生物活性的空間變化，提出在根際革蘭氏陰性菌和真核微生物在同化根派生碳過程中最活躍，同時(shí)描述了圍繞根際的活性群落的空間系統(tǒng)變化[9]。   2.3SIP技術(shù)在土壤N循環(huán)中的應(yīng)用   15N作為生物體內(nèi)大分子合成的組成元素，可結(jié)合SIP技術(shù)研究土壤中氮循環(huán)過程的各類微生物功能群及其相互作用。Georg等利用標(biāo)記和未標(biāo)記的N進(jìn)行純微生物培養(yǎng)，結(jié)果顯示15N-DNA-SIP技術(shù)是可行的，但存在一定局限性，如可視條帶需要大量的DNA，15N-DNA的理想豐度要求大于50%等[33]。Buckley等通過改變基因G+C含量來增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分離強(qiáng)度，為原位追蹤利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鑒定了獨(dú)立生存的固氮微生物，通過分析15N標(biāo)記DNA的16SrRNA，發(fā)現(xiàn)了3組新固氮微生物[34-35]。賈仲君等采用SIP技術(shù)示蹤農(nóng)田土壤氨氧化微生物DNA，發(fā)現(xiàn)相對(duì)于古菌，細(xì)菌是土壤硝化過程的主要驅(qū)動(dòng)者[36]。賀紀(jì)正等對(duì)農(nóng)田土壤生態(tài)系統(tǒng)中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化細(xì)菌（AOB）進(jìn)行一系列研究，得出二者在根際土壤中的豐度、組成對(duì)環(huán)境的響應(yīng)占主導(dǎo)作用[37]，并發(fā)現(xiàn)土壤中硝化作用伴隨著古菌amoA的基因豐度和多樣性變化，進(jìn)一步證明了氨氧化古菌可同化CO2，屬于自養(yǎng)型微生物[38]。Jennifer等結(jié)合RNA-SIP和DNA-SIP技術(shù)，再次證明AOA可通過兩種途徑固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到驗(yàn)證，進(jìn)而強(qiáng)調(diào)了AOA在硝化和CO2固定過程中的重要性[39]。Karen等以北美黃松林為研究對(duì)象，應(yīng)用H218O-SIP技術(shù)調(diào)查土壤中氨氧化微生物的生長與死亡情況，發(fā)現(xiàn)人工添加氨可刺激AOB的生長，與此同時(shí)AOA的死亡數(shù)量增加，而AOB則不受影響[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消減過程時(shí)，用13C標(biāo)記的琥珀酸鹽作為電子供體，鑒定了同化琥珀酸鹽的微生物，指出大多數(shù)N2O消減微生物屬于草螺菌屬和固氮螺菌屬。并證明前者消減速度大于后者，在水稻土N2O的減少過程中發(fā)揮重要作用[41]。#p#分頁標(biāo)題#e#   3研究展望   SIP技術(shù)能有效降低環(huán)境微生物群落分析的復(fù)雜度，獲得功能微生物的目的基因，已成為原位分離功能微生物的重要手段。隨著新一代454高通量測(cè)序技術(shù)的發(fā)展，SIP技術(shù)可最大程度地認(rèn)識(shí)不可培養(yǎng)微生物的遺傳組成和生命活動(dòng)，獲取其功能基因，優(yōu)化并人工合成在原位環(huán)境中具有高效同化或降解作用的新基因。結(jié)合土壤化學(xué)等方面知識(shí)，共同探討土壤環(huán)境中功能微生物的代謝途徑和同化過程，挖掘微生物基因資源，鑒別土壤關(guān)鍵元素循環(huán)的微生物驅(qū)動(dòng)機(jī)制等，將是未來研究發(fā)展的熱點(diǎn)和重點(diǎn)。

20世紀(jì)70年代后期，科學(xué)家在東太平洋洋隆（EPR）和加拉帕戈斯擴(kuò)張中心發(fā)現(xiàn)了一種低溫?zé)嵋簭男滟|(zhì)基巖的裂隙中彌散溢出，在這些彌散流的溢出點(diǎn)周圍發(fā)育著大量的與硫氧化菌共生的管狀蠕蟲和雙殼貝類熱液生物群落［1］。此后的幾十年來，大量的現(xiàn)代海底熱液活動(dòng)相繼被報(bào)道，而在這些海底熱液場(chǎng)中，大范圍的低溫彌散流區(qū)域總是同時(shí)伴隨著高溫集中流出現(xiàn)［2－4］。這些熱液環(huán)境中發(fā)育的生態(tài)群落與地球上其它以光合作用為基礎(chǔ)的生態(tài)群落有所不同，它們是以化能合成的自養(yǎng)微生物為基礎(chǔ)。這些微生物通過氧化熱液流體中的還原性物質(zhì)（CH4，H2，H2S，F(xiàn)e2＋和Mn2＋等），從而獲取新陳代謝的能量［5－7］。研究者采用比較測(cè)量等手段對(duì)熱液場(chǎng)進(jìn)行詳盡地分析后發(fā)現(xiàn)，低溫彌散流的化學(xué)通量比高溫集中流大［8］，熱通量也是高溫集中流的幾倍以上［9－10］。因此，低溫?zé)嵋簩?duì)于依靠流體中的化學(xué)物質(zhì)生長與繁衍的熱液生態(tài)群落具有更重要的意義。然而相對(duì)高溫?zé)嵋簢娍诖罅康奈⑸飳W(xué)研究，人們對(duì)低溫?zé)嵋簭浬⒘鞯年P(guān)注程度仍非常低［11－12］。近年來，隨著對(duì)熱液系統(tǒng)的研究深入，人們逐漸認(rèn)識(shí)到低溫?zé)嵋簩?duì)海洋熱通量和化學(xué)通量的貢獻(xiàn)，以及對(duì)生命起源和深部生物圈探索的意義，對(duì)低溫?zé)嵋簭浬⒘鞯奈⑸镅芯恳仓匾暺饋恚?3－17］。本研究綜述了近年來低溫?zé)嵋簭浬⒘鲄^(qū)域微生物生態(tài)的研究進(jìn)展，以及這些研究對(duì)深部生物圈探索的啟示。   1　海底低溫?zé)嵋簭浬⒘鞯男纬蓹C(jī)制與化學(xué)組成   研究低溫彌散流的形成機(jī)制與熱液地球化學(xué)環(huán)境參數(shù)的變化，對(duì)于理解低溫彌散流區(qū)域微生物多樣性與變化具有重要意義。研究者結(jié)合目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的低溫?zé)嵋簭浬⒘鳠嵋簣?chǎng)的數(shù)據(jù)，提出了低溫?zé)嵋毫黧w的3種形成機(jī)制：1）高溫?zé)嵋合喾蛛x的流體與洋殼中海水相互混合而被稀釋［11－12］；2）高溫?zé)嵋毫黧w在淺層地殼中的傳導(dǎo)性冷卻；3）高溫流體、海水和被改造的海水的3組分相混合［18］。這3種機(jī)制中由第一種占據(jù)主導(dǎo)地位，共同控制現(xiàn)代海底熱液彌散流的形成［19］。海底低溫?zé)嵋簭浬⒘黧w的化學(xué)組成復(fù)雜，通常富含CO2，CH4，H2，H2S和Si在一些樣品中也富含F(xiàn)e2＋，Mn2＋［4，20－24］（表1）。它們的組成在時(shí)間和空間上是高度變化的［5，17，25－27］，即使在同一個(gè)熱液區(qū)域，如東北太平洋形成的低溫?zé)嵋毫黧w，其熱液化學(xué)成分的變化也很大（表1）。這種多變性是由熱液終端端元流體的時(shí)空變化所控制，并受到深海底部的熱液流體稀釋強(qiáng)度的影響［2，5，25，28］；另外，海底深部傳導(dǎo)性熱交換、沉淀過程、火山活動(dòng)、潮汐作用以及微生物改造等也是影響化學(xué)成分多變性的重要因素［17］。總之，低溫?zé)嵋毫黧w中化學(xué)組分多變，富含豐富的還原性物質(zhì)，正是這些還原性物質(zhì)所引起的氧化還原放能反應(yīng)為海底熱液生態(tài)系統(tǒng)的繁衍提供了充足的物質(zhì)基礎(chǔ)。   2　海底低溫?zé)嵋簭浬⒘鲄^(qū)微生物生態(tài)的研究進(jìn)展   目前，對(duì)現(xiàn)代海底低溫?zé)嵋簭浬⒘鲄^(qū)微生物學(xué)的研究手段主要為傳統(tǒng)的富集分離培養(yǎng)和非培養(yǎng)技術(shù)［30］；特別是基于16SrRNA基因和特征性功能基因的系統(tǒng)發(fā)育分析等現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，加快了對(duì)現(xiàn)代熱液系統(tǒng)微生物研究的步伐。目前在大多數(shù)已發(fā)現(xiàn)的低溫?zé)嵋簠^(qū)域都有關(guān)于熱液微生物的研究報(bào)道，包括胡安•德福卡洋脊［13，15，31］，大西洋中脊［24］，有機(jī)質(zhì)豐富的Guaymas盆地［32］，沖繩海槽［33］，馬里亞納擴(kuò)展盆地［34］和深海海山［22，35］等。研究結(jié)果表明，在這些低溫彌散流熱液場(chǎng)內(nèi)的微生物具有一些共同的生態(tài)學(xué)特征：微生物生物量大、種類豐富、覆蓋廣。其中已發(fā)現(xiàn)的微生物種類包括α，β，γ，ε，ζ和δ變形桿菌，酸桿菌門（Acidobacteria）、產(chǎn)水菌目（Aquificales）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、壁厚菌門（Firmicutes）、浮霉?fàn)罹≒lanctomycetes）、各種Candidate　Divisions細(xì)菌、嗜熱球菌（Thermococcus）、甲烷球菌（Methanococcus）和其他一些嗜熱和超嗜熱古菌等［15，31－32，34，36－39］。在這些豐富的微生物類型中，化能合成自養(yǎng)微生物是海底熱液系統(tǒng)中生命新陳代謝的初級(jí)能量制造者，它們的存在是熱液生物群落繁衍的基礎(chǔ)。這些化能合成反應(yīng)包括了硫氧化、鐵氧化、氫氧化、甲烷氧化和硫酸鹽還原等，其中硫氧化與鐵氧化反應(yīng)最為重要，與之相關(guān)的微生物在低溫?zé)嵋簣?chǎng)中的發(fā)現(xiàn)也最為頻繁（表2）。   2．1　硫氧化微生物   與硫氧化相關(guān)的新陳代謝反應(yīng)是低溫?zé)嵋涵h(huán)境中微生物獲取能量的重要途徑。與周圍背景環(huán)境相比，低溫?zé)嵋簭浬⒘髦蠬2S的濃度相對(duì)周圍海水呈數(shù)量級(jí)倍數(shù)增加［22］，這些含硫化合物的存在為化能合成自養(yǎng)微生物提供了新陳代謝反應(yīng)所需的電子供體［42］。目前在低溫?zé)嵋合到y(tǒng)中發(fā)現(xiàn)的硫氧化微生物主要屬于ε、γ和α變形桿菌。ε變形桿菌的生理機(jī)能多樣，能在高溫條件下以硫元素的化學(xué)反應(yīng)進(jìn)行自養(yǎng)或異養(yǎng)活動(dòng)［43］，其中的一些類群是典型的從硫或硫代硫酸鹽氧化反應(yīng)過程中獲取能量的微生物，如Sulfurovum　lithotrophica，Sulfu－rimonas，Thiovulumspp．和弓形桿菌Arcobacter　spp．等。ε變形桿菌在熱液環(huán)境中廣泛存在，包括流體、微生物菌席或與熱液大型生物共生［36，44－47］。Opatkiewicz等［43］在胡安•德福卡洋脊Axial海山上的低溫?zé)嵋簣?chǎng)中就發(fā)現(xiàn)了豐富的ε變形桿菌，并指出它們的分布與流體中氫、硫和鐵等元素的濃度有關(guān)。Rassa等［35］在夏威夷Loihi海山上的低溫?zé)嵋簣?chǎng)中不同溫度梯度的彌散流處放置了41個(gè)原位生長微腔體（microbialgrowth　chambers）。經(jīng)過短期（4～10d）和長期（1～6a）的觀測(cè)，發(fā)現(xiàn)在中間溫度（51℃）的彌散流處ε變形桿菌是微生物群落的主要組成之一，而在溫度較高處（71℃）其占據(jù)更主導(dǎo)的地位。此外，Perner等［24］在大西洋中脊最南部（9°S）的Lilliput低溫?zé)嵋簣?chǎng)中也發(fā)現(xiàn)了大量的ε變形桿菌，有長桿、絲縷、短桿和球狀等多樣形態(tài)結(jié)構(gòu)。除了ε變形桿菌外，γ變形桿菌中的Thiomicrospira　spp．也是熱液環(huán)境中常見的硫氧化菌。如在Lilli－put低溫?zé)嵋簣?chǎng)，γ變形桿菌中的Thiomicrospira　spp．與ε變形桿菌一樣占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位［24］。Podgorsek等［40］在斐濟(jì)盆地北部的富H2S的低溫彌散流熱液場(chǎng)中也分離獲得大量α和γ變形桿菌中的自養(yǎng)或兼養(yǎng)硫氧化細(xì)菌。#p#分頁標(biāo)題#e#   2．2　鐵氧化微生物   鐵既可以作為化能自養(yǎng)的電子供體也可以作為厭氧呼吸的電子受體［48］。低溫?zé)嵋簭浬⒘黧w中富含的還原性鐵為鐵氧化的自養(yǎng)微生物提供了豐富的能量，因此在富鐵的海底熱液低溫彌散流區(qū)域內(nèi)發(fā)現(xiàn)了鐵氧化菌的廣泛分布。目前在熱液場(chǎng)中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的鐵氧化微生物包括α、β和γ變形桿菌，如赭色纖毛菌Lepto－thrix　ochracea，含鐵嘉氏鐵柄桿菌Galliionella　ferruginea，Gallionella　capsiferriformans，Sideroxydanslithotrophicus等［49－51］，以及最近發(fā)現(xiàn)的ζ變形桿菌［52］。Mariprofundus　ferrooxydans是從Loihi海山上富鐵菌席中分離獲得（圖1a），它是1種嗜中性的化能自養(yǎng)鐵氧化菌，以二氧化碳為碳源，能從二價(jià)鐵轉(zhuǎn)變成三價(jià)鐵的氧化反應(yīng)中獲取新陳代謝的能量［52－53］。通過對(duì)純培養(yǎng)微生物M．ferrooxydans的分類鑒定結(jié)果進(jìn)行評(píng)估，人們將其劃歸為變形桿菌門下一個(gè)新的亞類－ζ變形桿菌。ζ變形桿菌在低溫?zé)嵋毫黧w及其沉積物中的發(fā)現(xiàn)具有重要意義。因?yàn)閺?0世紀(jì)80年代開始，在現(xiàn)代和古代的熱液礦物中發(fā)現(xiàn)了大量的莖狀鐵氧化物［54］，當(dāng)時(shí)科學(xué)家從形態(tài)學(xué)上推測(cè)這是1種生物成因的鐵氧化物，但卻缺乏有力的生物學(xué)證據(jù)。而最近的研究發(fā)現(xiàn)，M．ferrooxydans在生長過程中能夠產(chǎn)生結(jié)構(gòu)相似的鐵氧化物（圖1b）［53］，當(dāng)其死亡后鐵氧化物并能在其表面保存下來（圖1c）［53，55］。因而，ζ變形桿菌的發(fā)現(xiàn)為莖狀鐵氧化物的生物成因推論提供了有力的支持。人們最初認(rèn)為ζ變形桿菌在自然界中的分布比較少，而隨著進(jìn)一步調(diào)查后發(fā)現(xiàn)它們其實(shí)廣泛分布于一些富鐵的低溫?zé)嵋簣?chǎng)中。例如，在Tonga　Arc海山上發(fā)現(xiàn)了一些富鐵低溫彌散流（30～70℃，Volcano　1），其流體形成的主要礦物是二峰水鐵礦（two－line　ferrihydrite）。透射電鏡顯示，這些鐵氧化物的形態(tài)與M．ferrooxydans形成的構(gòu)型非常一致［56］，隨后的分子生物學(xué)的研究結(jié)果也證實(shí)了在Volcano　1處分布了大量的ζ變形桿菌［41］。此外，Davis等［23］在胡安•德福卡洋脊Cleft段低溫彌散流場(chǎng)中所采集的沉積物柱也發(fā)現(xiàn)大量的ζ變形桿菌。而在馬里亞納盆地的低溫?zé)嵋簭浬⒘鲄^(qū)的微生物菌席中，熒光定量PCR的結(jié)果表明，它們更是占到了原核細(xì)胞總數(shù)的22％［34］。關(guān)于低溫彌散流中發(fā)現(xiàn)ζ變形桿菌的報(bào)道還有很多，如馬尼亞納島弧中的Eifuku海山和夏威夷Loihi海山［35］等。雖然對(duì)ζ變形桿菌發(fā)現(xiàn)的報(bào)道越來越多，然而目前對(duì)它們的研究尚屬起步階段，上述研究也表明，M．ferrooxydans只是ζ變形桿菌中一個(gè)較小的分支，僅憑一株可培養(yǎng)的M．ferrooxydans還不能將ζ變形桿菌的所有功能研究清楚。因此，還需要開展大量的ζ變形桿菌的適應(yīng)性培養(yǎng)工作，深入探索它們的生理化學(xué)特征。   2．3　氫氧化微生物   在超基性基巖上發(fā)育的海底低溫?zé)嵋簭浬⒘黧w中通常富含H2，H2在氧化過程中能釋放大量的能量，這就為以H2的氧化反應(yīng)獲取能量的微生物提供了存在的基礎(chǔ)。微生物消耗或產(chǎn)生氫氣是由氫化酶所催化，氫化酶包括3種，分別為［NiFe］－氫化酶、［FeFe］－氫化酶和［Fe］－氫化酶，它們之間并沒有分子進(jìn)化上的聯(lián)系［29，57］。Perner等［29］對(duì)大西洋中脊不同基底上發(fā)育的低溫?zé)嵋簣?chǎng)進(jìn)行了對(duì)比，研究對(duì)象包括ComfortlessCove熱液場(chǎng)中的Clueless低溫彌散流噴口（玄武質(zhì)基底）和Logatchev熱液場(chǎng)中的Quest彌散流噴口（超基性巖基底）。結(jié)果表明，以玄武質(zhì)為基底的Clueless低溫?zé)嵋毫黧w中H2濃度很低，且氫化酶基因僅有2種；而以超基性巖為基底的Quest低溫?zé)嵋毫黧w中H2濃度非常高，相應(yīng)的氫化酶基因也非常豐富。這一研究結(jié)果同時(shí)表明在海底低溫?zé)嵋簣?chǎng)中影響氫氧化微生物分布的重要因素是水體中H2和O2的濃度的大小［29］。目前在低溫?zé)嵋簠^(qū)域發(fā)現(xiàn)的氫氧化微生物有產(chǎn)水菌目（Aquificales），Dehalococcoidales，Desulfurococcale和ε變形桿菌中的一些下屬菌種微生物，以及利用H2和CO2產(chǎn)甲烷的甲烷球菌目Methanococcales等［29，58－60］。   2．4　其他新陳代謝途徑的微生物   除硫氧化、鐵氧化和氫氧化等化能自養(yǎng)微生物的頻繁出現(xiàn)外，在低溫?zé)嵋簢娍谖⑸锵到y(tǒng)中，甲烷氧化菌、產(chǎn)甲烷古菌、氨氧化古菌和硫酸鹽還原菌也是不可忽略的組成部分，它們通過自養(yǎng)或異氧方式進(jìn)行生命活動(dòng)。前人利用甲烷氧化（pmoA）、氨氧化（amoA）和硫酸鹽還原（dsrAB）等功能基因已經(jīng)對(duì)這些微生物在熱液環(huán)境中的分布進(jìn)行了研究。Nercessian等［61］對(duì)東太平洋洋隆13°N和大西洋中脊Rainbow熱液場(chǎng)的低溫流體、沉積物進(jìn)行了分析，通過功能基因發(fā)現(xiàn)了大量的甲烷氧化、產(chǎn)甲烷與硫酸鹽還原微生物的存在，包括超嗜熱的Methanopyrales和甲烷暖球菌科（Methanocaldococcaceae）、嗜熱和喜溫的甲烷球菌科（Methano－coccaceae），嗜熱的甲基熱菌屬（Methylothermus）和喜溫的I型甲烷氧化菌，和超嗜熱的古烷菌目（Archaeo－globales）、嗜熱的熱脫硫桿菌目（Thermodesulfobacteriales）和喜溫的脫硫葉菌科（Desulfobulbaceae）。   3　海底低溫?zé)嵋簭浬⒘黧w所揭示的深部生物圈   低溫?zé)嵋毫黧w研究的一個(gè)重要意義在于其環(huán)境是研究地球深部生物圈的窗口［62］。Gold［63］認(rèn)為嗜熱與超嗜熱微生物占據(jù)了地殼的部分區(qū)域，其生物量很可能超過地表生物的總和。因?yàn)楹５咨喜?00m以內(nèi)的洋殼中孔隙度較高，熱液流體與海水在其中能夠輕易運(yùn)移而循環(huán)，這種循環(huán)能引起化學(xué)梯度的變化，其為一些極端微生物在洋殼深部中的生存提供了良好的物質(zhì)基礎(chǔ)和環(huán)境。在紐芬蘭島邊緣的ODP210鉆探結(jié)果顯示微生物存在的深度甚至可以延伸至1　600多m［64］。由于樣品采集的限制，直接導(dǎo)致對(duì)洋殼內(nèi)部的研究非常困難，所以，通過低溫?zé)嵋毫黧w的研究來探測(cè)洋殼深部生物圈就顯得彌足珍貴［13，15，31］。通過對(duì)流體中地球化學(xué)參數(shù)的分析，可以有效地了解微生物在深部生物圈中的生物地球化學(xué)作用，如O2，S2－，NO－3，SO2－4和H2的消耗，NH＋4和CH4的產(chǎn)生都是微生物在熱液流體中作用的標(biāo)志［16－17，25，65－66］。例如，在東太平洋9°50′N和Suiyo海山的熱液場(chǎng)中，通過對(duì)低溫?zé)嵋毫黧w與高溫?zé)嵋毫黧w中的甲烷與二氧化碳同位素的分餾證明了深海底部存在著產(chǎn)甲烷與甲烷消耗的微生物活動(dòng)的存在［19，27］。通過培養(yǎng)和非培養(yǎng)手段對(duì)低溫?zé)嵋毫黧w中微生物進(jìn)行研究，能更直接反映深部微生物的分布狀態(tài)和新陳代謝方式。例如，Holden等［13］在胡安•德福卡洋脊CoAxial低溫?zé)釓浬⒘黧w（15～30℃）中分離出了一些最佳生長溫度為55～60℃的嗜熱和超嗜熱微生物；在排除了這些微生物來自周圍高溫流體的微生物污染這個(gè)可能后，研究人員指出它們應(yīng)當(dāng)來源于環(huán)境溫度更適合其生存的洋殼深部。另外，Kato等［67］研究了馬里亞納南部熱液場(chǎng)中采用鉆孔所取得的低溫洋殼流體（2～69℃），表明在這些流體中存在大量的細(xì)菌和古菌，其中Thiomicrospira和ζ變形桿菌占優(yōu)勢(shì)地位，ζ變形桿菌的細(xì)胞數(shù)量占原核細(xì)胞總數(shù)的32％。這些對(duì)低溫?zé)嵋毫黧w的研究結(jié)果證明了洋殼深部生物圈的存在，其新陳代謝的能量主要來源于甲烷、鐵的氧化和硫的氧化與還原。#p#分頁標(biāo)題#e#   Huber等［15］通過對(duì)東北太平洋Axial海山的低溫?zé)嵋簣?chǎng)（Marker33）中流體微生物多樣性的長期跟蹤，基于前人對(duì)該區(qū)域地質(zhì)和化學(xué)的報(bào)道，提出了洋殼深部生物圈的微生物種群與熱液化學(xué)過程的理想模式（圖2）［15］。根據(jù)熱液與海水兩端元的混合模式，將洋殼上部深部生物圈內(nèi)劃分成3個(gè)層位：1）上層，以海水為主，混入了少量的熱液。海水為這一層中的微生物提供了足夠的碳源、能量和電子受體，其優(yōu)勢(shì)群體為喜溫的硫、鐵或甲烷的氧化者，如ε，ζ，β和γ變形桿菌等；2）最下面的深部層為厭氧、溫度高于50℃的環(huán)境，以熱液流體為主，并混入少量的海水。這個(gè)區(qū)域?yàn)橐恍┫矞厥葻岬牧蜻€原菌和利用熱成因有機(jī)質(zhì)的嗜熱古菌提供了適合的生存環(huán)境，如脫硫桿菌屬（Desulfurobacterium）和熱球菌目（Thermococcales）［13，22，64］；3）中間層是化學(xué)梯度變化最大的氧化還原層，熱液流體和海水在此能夠充分混合，提供了從無氧到有氧，中溫到高溫的各種微環(huán)境。該層中主要發(fā)育一些厭氧嗜溫的產(chǎn)甲烷生物，如甲烷球菌目（Methanococcales）或一些新發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌，如Candidate　Division　ABY1和WS6以及一些需氧或微需氧的硫、鐵與甲烷氧化細(xì)菌，如ε和γ變形桿菌［15］。   4　結(jié)　語   海底熱液系統(tǒng)是現(xiàn)代海洋科學(xué)研究的熱點(diǎn)，近年來，該系統(tǒng)中的低溫?zé)嵋簭浬⒘魇艿皆絹碓蕉嗟年P(guān)注。通過對(duì)低溫彌散流區(qū)域微生物學(xué)的研究，我們逐步了解低溫彌散流區(qū)域的微生物生態(tài)學(xué)特征及化能合成自養(yǎng)微生物，尤其是鐵氧化和硫氧化相關(guān)的化能自養(yǎng)微生物在低溫?zé)嵋簠^(qū)域的分布規(guī)律，充分認(rèn)識(shí)到這些自養(yǎng)微生物在熱液生態(tài)系統(tǒng)中的支柱作用，并肯定了地球化學(xué)因素對(duì)微生物生態(tài)分布的制約。對(duì)低溫?zé)嵋毫黧w中的微生物研究，也為我們得以窺探深部生物圈，進(jìn)一步揭示地殼深部微生物的新陳代謝機(jī)理，從而了解其生命演化與發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。   然而，目前國內(nèi)外在這方面所開展的研究工作還有一定的局限性，包括樣品的采集、原位地球化學(xué)參數(shù)的分析以及生物學(xué)手段自身的缺陷，都會(huì)對(duì)當(dāng)前的研究結(jié)果造成影響。其局限性主要表現(xiàn)為：首先，由于DNA在常溫條件下容易降解，這就為樣品的保存和及時(shí)分析提出了嚴(yán)格的要求。但受到船載實(shí)驗(yàn)設(shè)備的限制，樣品在船上不能立即展開分析，只能采取室內(nèi)分析，而且從采集、存儲(chǔ)、運(yùn)輸和室內(nèi)分析這一過程往往需要花費(fèi)較長的時(shí)間，這就在一定程度上導(dǎo)致了樣品中微生物量的失真和群落結(jié)構(gòu)的細(xì)微變化。其次，原位流體化學(xué)數(shù)據(jù)缺失嚴(yán)重。原位流體化學(xué)數(shù)據(jù)能夠有效反映原位沉積環(huán)境的信息，但是目前的采樣手段主要是電視抓斗和海底拖網(wǎng)，這些采樣設(shè)備在起樣的過程中會(huì)導(dǎo)致背景海水與原位流體大量的混合，從而造成原位流體數(shù)據(jù)失真。因此，這就需要科學(xué)與技術(shù)的完美結(jié)合，進(jìn)一步完善海底熱液研究的技術(shù)手段，如我國正大力發(fā)展的載人深潛器和海底觀測(cè)網(wǎng)的建設(shè)。這些技術(shù)手段的實(shí)現(xiàn)將對(duì)海底低溫?zé)嵋簣?chǎng)原位數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確測(cè)量和連續(xù)觀測(cè)提供有力的保障。另外，基因芯片的應(yīng)用可以全面而翔實(shí)地獲取原位環(huán)境中微生物新陳代謝途徑的信息，而針對(duì)低溫?zé)嵋海壳笆澜缟线€未展開類似的工作。這些新的采樣、測(cè)量和分析技術(shù)的運(yùn)用，將進(jìn)一步揭示低溫?zé)嵋簠^(qū)微生物與地球化學(xué)的相互耦合、生物礦化機(jī)制、微生物對(duì)洋殼的改造、深部生物圈的演化以及生命起源等重大科學(xué)問題的答案。

【摘要】為了確保我國國民的身體健康，必須要對(duì)所有市場(chǎng)上的食品進(jìn)行微生物檢測(cè)。現(xiàn)階段我國常用的針對(duì)食品進(jìn)行微生物檢測(cè)的技術(shù)種類相對(duì)較多，而在針對(duì)不同食品進(jìn)行檢測(cè)的過程中必須要合理地選擇檢測(cè)技術(shù)，這樣才能夠提高檢測(cè)的效率和檢測(cè)的準(zhǔn)確性。基于此，本文通過分析現(xiàn)階段食品微生物檢測(cè)技術(shù)的具體分類，以及在應(yīng)用過程中的現(xiàn)狀，探究食品微生物檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展前景和發(fā)展方向。

【關(guān)鍵詞】食品；微生物檢測(cè)技術(shù)；應(yīng)用現(xiàn)狀；展望

食品微生物檢測(cè)技術(shù)是當(dāng)前保證我國國民食品安全的重要基礎(chǔ)技術(shù)，隨著國民生活水平的不斷提高，國民對(duì)食物的種類和數(shù)量也有了更高的追求。但是現(xiàn)階段由于國民在食用食品的過程中，出現(xiàn)了很多食品安全事故，所以導(dǎo)致國民的生命健康受到了一定威脅，因此，食品管理人員必須要通過食品微生物檢測(cè)技術(shù)，提高食品的微生物檢測(cè)準(zhǔn)確度，確保在市場(chǎng)上進(jìn)行流通的食品能夠具備相應(yīng)的安全性，在食品的生產(chǎn)、加工及包裝、運(yùn)輸?shù)冗^程中，要針對(duì)不同的環(huán)節(jié)，采取合理的微生物檢測(cè)技術(shù)，確保我國國民不會(huì)因?yàn)槭称返奈⑸镂廴径霈F(xiàn)一系列的病癥。

1傳統(tǒng)食品檢測(cè)技術(shù)

當(dāng)前，一些傳統(tǒng)的食品檢測(cè)技術(shù)還在我國食品微生物檢測(cè)過程中具有廣泛的應(yīng)用，由于傳統(tǒng)的食品檢測(cè)技術(shù)具有豐富的實(shí)踐，所以在實(shí)際檢測(cè)過程中，雖然效率性得不到保障，但是仍然具備一定的準(zhǔn)確性，目前我國常用的傳統(tǒng)食品檢測(cè)技術(shù)主要分為顯微鏡檢測(cè)法和平板培養(yǎng)法，尤其是在平板培養(yǎng)法的應(yīng)用過程中，由于需要對(duì)食品進(jìn)行抽樣檢測(cè)，并且提取相應(yīng)的微生物組織，所需要的時(shí)間相對(duì)較長。因此，傳統(tǒng)食品檢測(cè)技術(shù)可能不符合現(xiàn)階段我國逐漸發(fā)展的食品檢測(cè)流程。不過仍然要對(duì)傳統(tǒng)的食品檢測(cè)技術(shù)進(jìn)行相應(yīng)的分析，確保一些科技相對(duì)最為落后的地區(qū)，能夠通過傳統(tǒng)的顯微鏡檢測(cè)法和平板培養(yǎng)法，對(duì)食品中的微生物進(jìn)行合理的檢測(cè)，保證我國國民的生命健康和食品安全。

1.1顯微鏡檢測(cè)法。顯微鏡檢測(cè)法是現(xiàn)階段在微生物檢測(cè)過程中較為常用的方法，通過顯微鏡檢測(cè)法不僅可以更加直觀的檢測(cè)出微生物的數(shù)量和形態(tài)，還可以提高檢測(cè)的效率，通過顯微鏡對(duì)食品進(jìn)行檢測(cè)，存在的優(yōu)缺點(diǎn)主要體現(xiàn)在以下兩個(gè)方面：首先，由于在使用顯微鏡檢測(cè)的過程中，只需要通過染色油鏡進(jìn)行鏡檢即可，因此，其在檢測(cè)時(shí)更加具備快捷性和簡(jiǎn)便性。即使一些對(duì)于微生物檢測(cè)方法不太了解的工作人員，在食品進(jìn)行微生物檢測(cè)的過程中，只要掌握了顯微鏡的使用方法，也可以明確食品中的微生物形態(tài)及數(shù)量，同時(shí)顯微鏡檢測(cè)方法由于在我國食品安全的應(yīng)用過程中時(shí)間相對(duì)較長，所以具備豐富的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)和理論基礎(chǔ)，所以為食品安全檢測(cè)工作人員提供了很多的方便。但是顯微鏡檢測(cè)方法也具有一定的缺點(diǎn)，例如在針對(duì)微生物進(jìn)行檢測(cè)的過程中，由于只可以看到微生物的具體位置和數(shù)量，但是不能夠明確微生物的生存狀態(tài)，一旦過多的活性微生物在食品中，仍然會(huì)導(dǎo)致食品具有較大的毒性。所以顯微鏡檢測(cè)法作為傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中的重要組成部分，在后期的使用過程中，可能會(huì)具備一定的局限性。同時(shí)負(fù)責(zé)顯微鏡檢測(cè)法使用的工作人員也應(yīng)該明確現(xiàn)階段產(chǎn)生的新型檢測(cè)技術(shù)，并且盡量結(jié)合新型的檢測(cè)技術(shù)與顯微鏡檢測(cè)法相結(jié)合，確保能夠提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性和檢測(cè)效率，使我國傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)既不會(huì)喪失應(yīng)有的價(jià)值，又可以更加廣泛的應(yīng)用在現(xiàn)階段的食品微生物檢測(cè)中。

1.2平板培養(yǎng)法。在傳統(tǒng)檢測(cè)技術(shù)中的第二種經(jīng)典方法為平板培養(yǎng)法，這是在現(xiàn)階段我國食品微生物檢測(cè)中最為經(jīng)典的方法，通過這種方法可以對(duì)微生物的具體生存狀態(tài)，數(shù)量以及種類等進(jìn)行明確的判斷。平板培養(yǎng)法的優(yōu)點(diǎn)主要體現(xiàn)在實(shí)際的培養(yǎng)過程中，由于可以真正的將食品中的微生物進(jìn)行相應(yīng)的培養(yǎng)，并且明確微生物的具體種類，所以在實(shí)際檢測(cè)的過程中，可以為食品安全檢測(cè)提供一定的理論基礎(chǔ)，但是這種方法也存在很多的缺點(diǎn)，例如使用平板培養(yǎng)法時(shí)間相對(duì)較長，并且操作也相對(duì)較為復(fù)雜，而且針對(duì)培養(yǎng)的環(huán)境要求更為苛刻，既需要保證無菌培養(yǎng)又需要在適當(dāng)?shù)臏囟群蜐穸拳h(huán)境下進(jìn)行培養(yǎng)，所以在進(jìn)行檢測(cè)的過程中降低了檢測(cè)的效率，因此，這種傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)，已經(jīng)不再適用于現(xiàn)階段對(duì)所有種類食品進(jìn)行檢測(cè)的過程中。由于檢測(cè)效率相對(duì)較低，現(xiàn)階段這種檢測(cè)方法已經(jīng)不再被我國食品安全監(jiān)管部門廣泛使用。

摘要：為研究我國內(nèi)蒙古特色干制發(fā)酵乳制品中微生物物種多樣性、游離氨基酸和短鏈脂肪酸組成的其相關(guān)性。該研究通過高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)內(nèi)蒙古地區(qū)5種特色干制發(fā)酵乳制品中的微生物16SrDNAV4~V5區(qū)測(cè)序分析其細(xì)菌多樣性，利用GC-MS和HPLC分別測(cè)定短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量。結(jié)果表明奶渣子的微生物，群落多樣性和總體豐度最高。5種樣品之間的微生物群落物種組成差異較大，在屬水平上阿如勒、奶豆腐和酸奶豆腐的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳球菌屬（Lactococcus）和乳桿菌屬（Lactobacillus），奶皮子的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為假單胞菌屬（Pseudomonas）和不動(dòng)桿菌屬（Acinetobacter），奶渣子的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌為乳球菌屬（Lactococcus）和沙雷氏菌屬（Serratia）。在主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）中，酸奶豆腐和奶豆腐的樣兩者之間的物種組成度相似度最高。短鏈脂肪酸分析中，共檢測(cè)出23種短鏈脂肪酸，奶皮子含有短鏈脂肪酸的種類最多，游離氨基酸分析中，共檢測(cè)出24種游離氨基酸，奶豆腐包含24種游離氨基酸，且含量也明顯高于其他4個(gè)樣品，5種樣品中所包含同種的短鏈脂肪酸和游離氨基酸含量均存在顯著差異（P＜0.05）。在冗余分析（redundancyanalysis，RDA）中，羥脯氨酸和谷氨酸與乳球菌（Lactococcus）和乳桿菌（Lactobacillus）呈現(xiàn)正相關(guān)，綠膿桿菌（Pseudomonas）與丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈現(xiàn)正相關(guān)。研究揭示了內(nèi)蒙古特色干制發(fā)酵乳制品中微生物組成、短鏈脂肪酸和游離氨基酸之間的關(guān)系，為傳統(tǒng)發(fā)酵干制乳制品產(chǎn)業(yè)發(fā)展優(yōu)化提供一定的理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：短鏈脂肪酸；游離氨基酸；微生物多樣性；高通量測(cè)序；干制乳制品

發(fā)酵是一種有著數(shù)千年歷史的食品保存和加工的方法[1]，發(fā)酵賦予食品豐富的微生物組成使其具有獨(dú)特的風(fēng)味和營養(yǎng)組分[2]。傳統(tǒng)發(fā)酵制品多采用自然發(fā)酵的方式，而自然發(fā)酵過程中的微生物多來自于外部環(huán)境[3-4]，因此不同的地理環(huán)境和氣候條件造就了各具特色的發(fā)酵制品。內(nèi)蒙古地區(qū)位于我國北部地區(qū)，獨(dú)特的氣候條件和自然資源成功造就了內(nèi)蒙古地區(qū)“世界黃金奶源帶”的地位，豐富和優(yōu)質(zhì)的奶資源為各類乳制品的產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。發(fā)酵乳制品作為乳制品中的典型代表，已成為不同牧區(qū)主要的創(chuàng)收乳制品。阿如勒、奶豆腐、奶皮子、奶渣子和酸奶豆腐作為內(nèi)蒙古地區(qū)最具代表的干制發(fā)酵乳制品，因其營養(yǎng)豐富且風(fēng)味獨(dú)特而一直受到消費(fèi)者的青睞。食品發(fā)酵中微生物的代謝決定食品的風(fēng)味和營養(yǎng)[5]，發(fā)酵食品的風(fēng)味主要來源于食品中的呈味物質(zhì)如游離氨基酸[6]。短鏈脂肪酸的產(chǎn)生受到微生物群的數(shù)量和類型的影響[7]，與發(fā)酵食品的營養(yǎng)品質(zhì)和理化性質(zhì)密切相關(guān)[8]。產(chǎn)生短鏈脂肪酸的益生菌主要有乳球菌、乳桿菌、雙歧桿菌等，有助于促進(jìn)干制發(fā)酵乳制品中蛋白和脂肪的酶解，產(chǎn)生游離氨基酸和短鏈脂肪酸，可以改善干制發(fā)酵乳制品的風(fēng)味和營養(yǎng)特性[9-10]。傳統(tǒng)的發(fā)酵技術(shù)極好的保存了自然條件下的微生物組成，微生物在發(fā)酵過程中占據(jù)主要作用[11]。傳統(tǒng)培養(yǎng)方法對(duì)于微生物群落的組成研究方法具有一定的局限性，高通測(cè)序技術(shù)屬于非培養(yǎng)方法，具有通量高，不偏向優(yōu)勢(shì)菌群的條件下測(cè)序真實(shí)、客觀、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，能夠全面解析食品中微生物群落結(jié)構(gòu)，逐漸成為微生物群落多樣性解析的主要工具[12]。麻和平等[13]基于高通量測(cè)序分析比較不同保存溫度下牦牛酸奶細(xì)菌多樣性，周繼福等[14]基于高通量測(cè)序技術(shù)比較不同來源原料乳中的細(xì)菌特征，馬靜等[15]基于高通量測(cè)序技術(shù)分析青藏高原牦牛和犏牛乳中微生物多樣性的研究。本研究通過采集內(nèi)蒙古地區(qū)五種最具特色的干制發(fā)酵乳制品，通過分析微生物物種多樣性組成，測(cè)定游離氨基酸和短鏈脂肪酸含量，探討微生物、游離氨基酸和短鏈脂肪酸對(duì)干制發(fā)酵乳制品品質(zhì)風(fēng)味和營養(yǎng)物質(zhì)之間的關(guān)系。

1材料與方法

1.1材料與試劑

干制乳制品阿如勒（ARL）、奶豆腐（NDF）、奶皮子（NPZ）、奶渣子（NZZ）和酸奶豆腐（SNDF）采自內(nèi)蒙古自治區(qū)錫林郭勒盟西烏珠穆沁旗地區(qū)；E.Z.N.A.®soil試劑盒，美國OmegaBio-tek公司；瓊脂糖，西班牙biowest公司；FastPfu聚合酶，北京全式金生物技術(shù)有限公司；AxyPrepDNA凝膠提取試劑盒，美國Axygen公司；測(cè)序試劑盒，美國Illumina公司；鄰苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）（分析純）、氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyloxycarbonylchloride，F(xiàn)MOC）（分析純）、3-巰基丙酸（分析純）、17種氨基酸混合標(biāo)準(zhǔn)品（2.5μmol/mL）（天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸等），sigma；硼酸（分析純）、二水合磷酸二氫鈉（分析純）、十二水合磷酸氫二鈉（分析純）等，廣州化學(xué)試劑廠；甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）等，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司CNW。

1.2儀器與設(shè)備

0引言   土壤微生物是森林生態(tài)系統(tǒng)中的重要分解者，它分解動(dòng)植物殘?bào)w，促進(jìn)土壤腐殖質(zhì)的形成以及有機(jī)質(zhì)的分解和轉(zhuǎn)化，加快土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，改善土壤健康狀況，利于植物生長和發(fā)育[1-3]。土壤微生物數(shù)量和生物量是研究和評(píng)價(jià)土壤微生物調(diào)控功能的重要參數(shù)[4-6]。土壤微生物數(shù)量直接影響土壤的生物化學(xué)過程及土壤養(yǎng)分的組成與轉(zhuǎn)化，同時(shí)體現(xiàn)土壤中的生物活性，也是恢復(fù)和維持林地生產(chǎn)力的主要因素之一[2,7-8]。土壤微生物量可反映土壤同化和礦化能力的大小，是土壤活性大小的標(biāo)志[5]，其參與生態(tài)系統(tǒng)養(yǎng)分循環(huán)、有機(jī)質(zhì)分解等生態(tài)過程，影響土壤有機(jī)質(zhì)的轉(zhuǎn)化，因而在陸地生態(tài)系統(tǒng)碳氮循環(huán)中發(fā)揮著重要作用[9-10]。土壤微生物數(shù)量和生物量受氣候、土壤和植被因子的顯著影響，即使在相同的氣候條件和土壤類型下，不同植被下的土壤微生物仍然存在較大差異[11]。在森林生態(tài)系統(tǒng)中，土壤的理化性質(zhì)受凋落物、根活性和相關(guān)微氣象因子的影響，其中樹種組成起著決定性作用[12]。   以往有關(guān)植被對(duì)于土壤微生物影響的研究主要針對(duì)生態(tài)系統(tǒng)不同演替階段[13]、生態(tài)恢復(fù)和退化過程[14-15]，但對(duì)同一條件下不同植被類型，尤其是混交林的土壤微生物生物量的研究還比較少。馬尾松(Pinusmassoniana)和樟樹(Cinnamomumcamphora)是亞熱帶最常見的針葉林和闊葉林，在森林資源上占有重要地位。本試驗(yàn)在湖南省長沙市天際嶺國家森林植物園分別對(duì)樟樹林、馬尾松林、樟樹-馬尾松混交林土壤微生物數(shù)量和微生物碳氮生物量進(jìn)行研究，比較同一氣候條件下不同林型土壤微生物數(shù)量和生物量的差異，旨在揭示3種森林類型微生物數(shù)量和碳、氮生物量特征，以期為森林生態(tài)系統(tǒng)的碳氮循環(huán)機(jī)理、有機(jī)質(zhì)分解等提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。   1試驗(yàn)地概況   研究樣地位于湖南省長沙市天際嶺國家森林植物園(113°03'—113°04'E，28°06'—28°08'N)。屬典型的亞熱帶濕潤季風(fēng)氣候，年均氣溫17.1℃，1月最冷，平均為5.0℃，極端最低溫度為-11.3℃；7月最熱，平均氣溫為29.0℃，極端最高氣溫41.0℃；全年無霜期270~300天，年均日照時(shí)數(shù)1677.2h；雨量充沛，年均降水量1425mm。地層主要是第4紀(jì)更新世的沖積性網(wǎng)紋紅土和砂礫，屬于典型紅壤丘陵區(qū)。   研究樣地坡度為13°~20°，海拔55~100m；樟樹、馬尾松和混交林均為24年生的人工林，混交林為樟樹和馬尾松混交，其混交比例為4:6，3種群落基本情況見表1。林下植被有毛葉木姜子Litseamollis、油茶Camelliaoleifera、枸骨Ilexcornuta、山蒼子Litseacubeba、梔子Gardeniajasminoides、滿樹星Ilexaculcolata、狗脊蕨Woodwardiaprolifera、杜荊Vitexagnuscastus、大青Clerodendroncyrtophyllum、紫金牛Ardisiajaponica、黃檀Dalbergiabalansae、苔草Carextristachya、山麥冬RadixLiriopes、烏桕Sapiumsebiferum、喜樹Camptothecaacuminate、鱗毛蕨Dryopterischinensis、野柿Diospyroslotus、一枝黃花Solidagocanadensis、華山礬Symplocoschinensis、鹽膚木Rhuschinensis、白櫟Quercusfabri、小葉女貞Ligustrumquihoui、淡竹葉Lophatherumgracile、雞矢藤Paederiascandens、青桐Firmianasimplex、芒萁Dicranopterisampla、鐵線蕨Adiantumcapillusveneris、井欄邊草Pterismultifida、蛇葡萄Ampelopsissinica等。   2研究方法   2.1樣品采集   2009年7月初，在湖南省長沙市天際嶺國家森林植物園的馬尾松、樟樹、樟樹馬尾松混交林3種群落中，每種森林類型設(shè)置6塊3m×4m的固定樣地，每塊樣地間相隔10m以上。本次試驗(yàn)采樣時(shí)間是2011年7月初，采樣時(shí)，先去除地表面凋落物，用自制直徑5cm、長10cm的鋼管打入到地下0~10cm土層，取500g左右的土樣，3種林型共采集24個(gè)樣，然后將每種林型采集的6個(gè)樣進(jìn)行兩兩混和后，及時(shí)裝入自封袋帶回實(shí)驗(yàn)室放入冰箱4℃下保存，供土壤微生物數(shù)量和微生物生物量的測(cè)定。   2.2土壤微生物的分離與鑒定   土壤微生物數(shù)量的測(cè)定采用稀釋平板培養(yǎng)計(jì)數(shù)法，稀釋倍數(shù)為細(xì)菌10-4~10-6、真菌10-2~10-4、放線菌10-3~10-5，每個(gè)稀釋濃度做3個(gè)重復(fù)，選擇長出菌落數(shù)10~200的培養(yǎng)皿計(jì)數(shù)[16]。細(xì)菌分離采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，鑒定通過菌體形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察和生理生化指標(biāo)測(cè)定，具體參照文獻(xiàn)[17]。真菌分離采用孟加拉紅培養(yǎng)基，鑒定參照文獻(xiàn)[18-19]。放線菌分離采用高氏一號(hào)培養(yǎng)基，鑒定參照文獻(xiàn)[20]。   2.3土壤微生物生物量碳和氮的測(cè)定   土壤微生物量C、N采用氯仿熏蒸浸提方法測(cè)定[21]。提取液中C的測(cè)定用重鉻酸鉀-硫酸消煮，硫酸亞鐵滴定法，N的測(cè)定采用凱氏消煮法。微生物量C、N的計(jì)算，見公式(1)、(2)。Cmic=EC/KEC(1)Nmic=EN/KEN(2)式中：EC、EN分別表示熏蒸與未熏蒸土壤提取液中所測(cè)C、N含量之差，KEC、KEN分別表示微生物量C、N浸提測(cè)定的比例，數(shù)值分別為0.38、0.54。   2.4試驗(yàn)儀器   全自動(dòng)凱氏定氮儀（產(chǎn)地：山東；滴定精度：1μL/步）；石墨消解儀（產(chǎn)地：山東；精度：±1.0℃）；真空干燥器（產(chǎn)地：鞏義）；微生物培養(yǎng)箱（產(chǎn)地：寧波；精度：±1）；無菌操作臺(tái)（產(chǎn)地：天津；潔凈等級(jí)：100級(jí)）；高溫滅菌鍋（產(chǎn)地：山東）。   2.5統(tǒng)計(jì)分析   試驗(yàn)數(shù)據(jù)的處理和運(yùn)算采用Excel2003軟件，用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS18.0進(jìn)行單因素方差分析和相關(guān)性分析，檢驗(yàn)相同條件下土壤微生物數(shù)量、碳氮生物量的顯著差異性和相關(guān)性。   3結(jié)果與分析   3.13種林型土壤理化性質(zhì)及養(yǎng)分比較   由表2可知，3種林型土壤養(yǎng)分中含水量和土壤平均溫度差異都達(dá)到顯著水平(P<0.05)，其特征均為：樟樹>馬尾松>混交林。土壤中有機(jī)碳為：樟樹林>混交林>馬尾松林，其中樟樹林和馬尾松林之間差異性達(dá)到顯著水平(P<0.05)；土壤全氮為：樟樹林>混交林>馬尾松，其中樟樹林與馬尾松林、馬尾松林與混交林的差異性達(dá)到顯著水平(P<0.05)；pH值為：樟樹林>馬尾松林>混交林；凋落物量為：樟樹林>混交林>馬尾松林，3種林型之間差異性均達(dá)到顯著水平(P<0.05)。#p#分頁標(biāo)題#e#   3.2土壤微生物總數(shù)特征比較   對(duì)3種不同林型土壤微生物的總數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其微生物總數(shù)量分別為：樟樹林751.6×103個(gè)/g干土、混交林298.2×103個(gè)/g干土、馬尾松林174.3×103個(gè)/g干土，特征為樟樹林>混交林>馬尾松林（見圖1）。進(jìn)行單因素方差分析，結(jié)果表明3種森林類型的土壤微生物總數(shù)量存在顯著差異(P<0.05)，進(jìn)行組間兩兩比較，發(fā)現(xiàn)3種林型兩兩之間的微生物總數(shù)的差異性均顯著(P<0.05)；其差異特征說明3種不同森林類型的土壤微生物在其分布上存在明顯的非均勻性。   3.3森林類型與土壤中微生物的關(guān)系   由表3可知，3種林型微生物中細(xì)菌比例特征為樟樹林>馬尾松林>混交林，其比例分別為：樟樹林82.63%，馬尾松林78.39%，混交林64.46%；真菌比例特征為混交林>馬尾松>樟樹林，比例分別為：混交林18.55%，馬尾松林12.62%，樟樹林10.44%；放線菌比例特征為混交林>馬尾松>樟樹林，比例分別為：混交林18.55%，馬尾松林8.99%，樟樹林6.93%。可見，3種林型對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響有差異，這與不同的林型的凋落物量有一定關(guān)系[22]，從而影響其分解速率[23]。有研究[24]發(fā)現(xiàn)，不同林型混交林的土壤微生物數(shù)量組成比例也因林地不同而發(fā)生變化，不同林型的根際環(huán)境對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌也有不同影響[25]。   3.4土壤微生物生物量碳氮特征   由圖2可知，3種林型土壤微生物生物量碳的平均含量分別為543.01、421.48、370.95mg/kg，其特征為馬尾松林>混交林>樟樹林；微生物生物量氮平均含量為37.28、23.20、15.12mg/kg，特征則為：樟樹林>馬尾松林>混交林。進(jìn)行單因素方差分析，其結(jié)果表明3種森林類型的土壤微生物生物量碳、氮均不存在顯著差異(P>0.05)。進(jìn)行相關(guān)關(guān)系分析表明（見表4）：土壤微生物生物量碳和氮與土壤有機(jī)碳、全氮、碳氮比呈顯著線性相關(guān)，微生物生物量碳、氮均與土壤中水分相關(guān)性不顯著，微生物生物量碳氮之間也存在顯著線性相關(guān)。因此說明水分不是影響土壤中微生物生物量碳、氮的主要因素，土壤中的有機(jī)碳和全氮才是影響微生物生物量碳、氮的主要因素，而且微生物生物量碳與氮之間還會(huì)相互影響。   4結(jié)論   （1）3種林型下的土壤微生物總數(shù)量有顯著差異性(P<0.05)，總的特征是：微生物總數(shù)最大的是樟樹林，混交林次之，馬尾松林的數(shù)量最小。這種微生物數(shù)量的差異與林型存在密切關(guān)系，這在一定程度上反映了不同林型土壤有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化程度和肥力水平。   （2）林型對(duì)土壤微生物數(shù)量和比例有顯著的影響。不同林型生境為微生物提供了異質(zhì)性的生境條件，小生境理化因素的差異對(duì)3大類異養(yǎng)微生物的組成和比例有顯著的影響。研究結(jié)果表明，不同林型土壤微生物中細(xì)菌、放線菌、真菌的數(shù)量和比例都不盡相同。   （3）3種林型的土壤微生物生物量碳、氮無顯著差異性(P>0.05)。與土壤有機(jī)碳、全氮、碳氮比呈顯著線性相關(guān)，與土壤水分無明顯著的相關(guān)關(guān)系，表明土壤有機(jī)質(zhì)是影響土壤微生物生物量的重要因素。   5討論   不同凋落葉分解的土壤微生物效應(yīng)[26]研究結(jié)果表明，闊葉林凋落物分解速度影響土壤微生物的數(shù)量，其凋落物分解速度越快，其土壤微生物數(shù)量越多，而針葉林凋落物的土壤微生物效應(yīng)就較差。5種不同人工林型下土壤微生物類群數(shù)量特性[27]的研究結(jié)果表明，混交林群落中的土壤微生物總數(shù)比單一林型中的數(shù)量多，其原因可能是在混交條件下，合理布局空間，根系發(fā)達(dá)，加速有機(jī)物分解和養(yǎng)分的積累，加速土壤微生物的活動(dòng)，從而改善土壤的理化性狀，因此比單一林型更有利于微生物的生長。但是，本研究結(jié)果與眾多結(jié)論不同，經(jīng)過對(duì)比分析3種林型的基本條件發(fā)現(xiàn)，混交林林地密度大，郁閉度大，所以在相同關(guān)照條件下，地面溫度相對(duì)較低，光照條件比較差，地被植物少，凋落物多，導(dǎo)致土壤微生物數(shù)量減少[28]。   有研究[29-30]發(fā)現(xiàn)，土壤微生物中以細(xì)菌所占的比例最多，真菌次之，放線菌最少，土壤微生物的組成以細(xì)菌為主，占微生物總數(shù)的71.4%~87.7%，放線菌次之，占總數(shù)的9.2%~22.7%，真菌最少，占1.1%~9.6%。可見，不同林型對(duì)土壤微生物數(shù)量的影響效果有差異。其原因可能與不同的林型的凋落物量有一定關(guān)系[31]，從而影響其分解速率[32]。在不同混交林地土壤養(yǎng)分、微生物和酶活性的研究[33]中發(fā)現(xiàn)，不同林型的混交林的土壤微生物數(shù)量組成比例也因林地不同而發(fā)生變化，不同林型的根際環(huán)境對(duì)細(xì)菌、真菌和放線菌也有不同的影響[34]。   細(xì)菌的數(shù)量很大程度上與土壤有機(jī)質(zhì)含量呈正相關(guān)[35]。土壤細(xì)菌主要營養(yǎng)來源是植物殘?bào)w，在肥沃土壤和有機(jī)質(zhì)豐富的土壤中，細(xì)菌數(shù)量相應(yīng)偏多，而在缺乏有機(jī)質(zhì)的土壤中其數(shù)量較少[30]，本試驗(yàn)3種林型中以樟樹林的有機(jī)質(zhì)含量最高，因此樟樹林更有利于細(xì)菌的生長。而真菌則是以混交林最多，馬尾松林次之，樟樹林最少，這是因?yàn)檎婢啾确啪€菌和細(xì)菌更適合于pH較低的土壤條件下發(fā)育[36]，3種林型中混交林的pH相對(duì)較低，而真菌數(shù)量最多，這也與表2中的數(shù)據(jù)相印證。放線菌比例則是混交林所占比例最大，馬尾松次之，樟樹林最少。眾多研究[35,37]結(jié)論得出，放線菌具有喜熱耐旱以及適合在堿性的土壤環(huán)境中生存，本試驗(yàn)3種林型中雖然混交林放線菌所占比例最大，但放線菌總數(shù)以闊葉林最高，放線菌特征也與眾研究結(jié)論相符。   土壤微生物生物量與溫度、濕度、土壤理化性質(zhì)等環(huán)境因素有關(guān)[38-39]。本研究結(jié)果表明，土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮與土壤水分無顯著相關(guān)關(guān)系，說明在本研究的3種林型中土壤濕度不是影響土壤微生物生物量的限制性因子。關(guān)于微生物生物量碳氮與土壤水分關(guān)系的研究報(bào)道較多[40-42]，但至今都對(duì)其相關(guān)性沒有定論。另外，相關(guān)分析表明，土壤微生物生物量碳和氮與土壤有機(jī)碳、全氮呈顯著正相關(guān)，這表明土壤有機(jī)質(zhì)是影響土壤微生物量的重要因素[43]，有機(jī)質(zhì)含量高，就能夠?yàn)槲⑸镌谶M(jìn)行自身合成與代謝過程中提供足夠的碳、氮物質(zhì)來源以及能量來源[44]。此結(jié)果與以往研究結(jié)論相符，如金發(fā)會(huì)等石灰性土壤微生物量碳、氮與土壤顆粒組成和氮礦化勢(shì)的關(guān)系[45]研究結(jié)果表明，土壤微生物量碳和微生物量氮與土壤養(yǎng)分高度正相關(guān)。除有機(jī)碳、全氮與微生物生物量碳氮相關(guān)之外，杉木人工林土壤微生物生物量碳氮特征及其與土壤養(yǎng)分的關(guān)系[46]的研究結(jié)果揭示，土壤微生物量碳氮含量與銨態(tài)氮、全鉀和速效鉀含量之間存在顯著正相關(guān)；劉占鋒等[47]研究揭示，土壤微生物量碳與土壤全磷呈顯著正相關(guān)。#p#分頁標(biāo)題#e#

摘要：微生物與免疫學(xué)是高職高專藥學(xué)專業(yè)的一門必修課程，旨在使學(xué)生掌握微生物基礎(chǔ)知識(shí)、免疫學(xué)基礎(chǔ)等基本知識(shí)和技能。分析選擇藥學(xué)專業(yè)微生物與免疫學(xué)課程思政建設(shè)內(nèi)容的方法，并提供大量的案例素材。同時(shí)，結(jié)合授課經(jīng)驗(yàn)，分享如何將思政案例與專業(yè)理論內(nèi)容相結(jié)合。

關(guān)鍵詞：微生物與免疫學(xué)；課程思政；教學(xué)改革

微生物與免疫學(xué)課程覆蓋學(xué)生面廣，在科學(xué)研究、社會(huì)服務(wù)、實(shí)際工作及日常生活中均具有重要的應(yīng)用價(jià)值。在微生物與免疫學(xué)的發(fā)展、實(shí)踐過程中，我國科學(xué)家和世界各國研究人員都做出了卓越的貢獻(xiàn)，將他們的案例與課程知識(shí)點(diǎn)相結(jié)合，不但能使學(xué)生對(duì)理論知識(shí)點(diǎn)產(chǎn)生濃厚的興趣，也能“潤物無聲”地提高學(xué)生的思想政治修養(yǎng)，發(fā)揮“立德樹人”的作用[1]。

1思政視域下藥學(xué)專業(yè)微生物與免疫學(xué)課程思政建設(shè)內(nèi)容選擇

在實(shí)際授課中，一線教師就特別重視課堂理論知識(shí)與相應(yīng)思政點(diǎn)相融合的新型教學(xué)模式探究[2]。基于此，整理歸納思政素材對(duì)于新型教學(xué)模式的應(yīng)用就顯得尤為重要，本課程團(tuán)隊(duì)經(jīng)過不斷的探索、研究、實(shí)踐后，總結(jié)歸納出微生物與免疫學(xué)課程的思政素材庫，現(xiàn)進(jìn)行簡(jiǎn)單介紹，以期為其他教師提供思路與借鑒（見表1）。

1.1挖掘具有文化自信、人文素養(yǎng)的思政案例

現(xiàn)代免疫學(xué)發(fā)展了120多年，中國的傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)在人類與傳染病的“斗爭(zhēng)”中發(fā)揮著重要作用[3]。2020年初發(fā)生的新冠肺炎疫情是百年來全球發(fā)生的最嚴(yán)重的傳染病大流行，在抗疫過程中，中國政府反應(yīng)迅速，應(yīng)對(duì)及時(shí)，保證了疫情沒有大規(guī)模擴(kuò)散。這里面有中國的制度優(yōu)勢(shì)，其實(shí)還有一個(gè)獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，那就是傳統(tǒng)中醫(yī)藥的作用。這其中，“三藥三方”就發(fā)揮了重要的作用，“三藥”指的是血必凈注射液、金花清感顆粒、連花清瘟顆粒和膠囊3種中成藥；“三方”代表了宣肺敗毒方、清肺排毒湯、化濕敗毒方3個(gè)方劑。清肺排毒湯由東漢時(shí)期的張仲景所著的《傷寒雜病論》中的四首經(jīng)典方劑加減配伍而成[4]。連花清瘟顆粒和膠囊、金花清感顆粒、血必凈注射液、宣肺敗毒方和化濕敗毒方也是傳統(tǒng)中醫(yī)藥在防治傳染病方面發(fā)揮重要作用的代表。