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摘要：發光二極管（Light-emittingdiode，LED）是一種新型顯微照明光源。這種光源不但容易實現計算機編程控制，也易于排列成環形陣列光源。基于可編程的環形led陣列光源搭建的顯微成像系統，可以實現多種顯微成像模式，例如差分相襯顯微成像和暗場顯微成像等。本文提供了一種環形LED陣列光源顯微成像系統的設計方案，并給出了一些成像實例。

關鍵詞：發光二極管；顯微成像；成像系統設計

1概述

雖然有許多先進的顯微成像設備被發明，例如電子顯微鏡、原子力顯微鏡、熒光顯微鏡等，傳統的明場光學顯微鏡仍舊是生命科學、材料學等領域不可替代的基本工具之一[1-4]。明場光學顯微鏡由照明光源、成像透鏡組，以及載物臺等部分組成。其中照明一般采用柯勒照明方式[1-4]，照明光由鹵素燈這類熱光光源加熱燈絲產生。熱光光源雖然具有發光光譜寬、照明亮度高等優勢，但也存在光能轉化效率低，使用壽命短，需要散熱等缺點。而且，熱光光源燈絲要保證照明亮度，通常制成特定的彎曲形狀增大發光面積，只有使用復雜的光路，才能實現均勻的照明。相比之下，發光二極管（LED，Lightemittingdiode，LED）具有更高的發光效率，單色性好等優點，而且LED本身具有聚光鏡結構，LED芯片發出光線經過聚光鏡，可形成發散角較小的光束，當與樣品距離遠大于樣品的尺寸時，照射在樣品上的光束可近似看作平行光，無需復雜的光路，也可以提供均勻且高亮的樣品照明，因此，LED正逐漸取代傳統照明光源，在顯微成像領域發揮著越來越重要的作用[5-9]。此外，單顆LED體積較小，便于各種形式排布，實現各種入射角的調制照明，這是其他光源難以做到的。本文根據顯微鏡成像系統特點，結合環形LED陣列光源，給出了一套顯微成像系統設計思路，并列舉出了該裝置的使用實例，例如、差分相位顯微成像[10,11]、暗場成像[12]。

2顯微成像系統設計

由于環形LED陣列光源顯微成像系統，可以實現光場顯微成像、差分相位顯微成像、暗場顯微成像，需要對樣品進行軸向掃描拍攝。下面給出了一種實現軸向掃描自動化拍攝的顯微成像系統設計方案，該系統將包括硬件設計和軟件設計兩部分。在軟件的編程控制下，實現自動化的顯微成像拍攝。

2.1硬件設計

圖1所示是環形LED陣列光源顯微成像系統的硬件部分，由環形LED陣列光源，無限遠校正顯微成像系統，機械樣品位移臺以及成像探測器構成。其中環形LED陣列光源提供高亮且均勻的角度調制照明。在顯微成像系統中環形LED陣列光源被放置在樣品正下方，其所在平面垂直于光軸，光軸穿過環形LED陣列光源中心，LED指向決定照明數值孔徑，要求與當前顯微物鏡數值孔徑一致，與不同數值孔徑的物鏡匹配可采用多種環LED陣列光源，根據需要控制其點亮環與所使用的物鏡照明數值孔徑匹配。成像系統中，所使用的無限遠顯微系統由物鏡和管鏡構成，通過物鏡的光線在物鏡后不直接成像，而是形成平行光束，進入管鏡，在管鏡一倍焦距附成像，成像探測器感光面與管鏡后焦面重合。為了便于自動對焦、尋找感興趣區域，以及軸向掃描完成三維測量，機械樣品位移臺由一個長程二維水平X-Y位移裝置和一個長程高精度Z軸向位移臺組成，樣品托架被固定在位移臺頂端，位于環形LED陣列光源正上方。二維水平X-Y位移裝置的作用是在水平方向大范圍調整樣品位置，便于尋找感興趣區域，而Z軸向位移臺帶動樣品托架，實現高精度光軸z方向調節，實現自動對焦并獲取樣品不同層的顯微圖像。樣品托架用于固定待測樣品。

2.2軟件設計

軟件部分由拍攝準備程序段和拍攝程序段兩部分構成。準備程序包括光源初始化程序、位移臺初始化程序和相機初始化程序，在選擇成像模式時自動開啟。圖2是拍攝程序設計流程圖。圖2環形LED陣列光源顯微成像系統拍攝程序設計流程圖初始化程序段是為了計算機與檢測硬件間的通信狀態，一般相機初始化程序較復雜，因此一般先從檢測相機的初始化，調試順利執行后，再進行其他初始化操作。

3環形LED陣列光源顯微成像實驗

采用上述設計方案可以實現多種成像模式，且可以應用不用倍數物鏡，這里分別采用100倍物鏡和20倍物鏡分別進行實驗，驗證設計方案的可行性。

3.1差分相襯顯微成像

實驗中采用的環形LED陣列光源如圖3所示。該光源由60顆參數完全相同的LED燈珠等間隔排列在環形內面，外徑176mm，內徑140mm，整體厚度15mm，發光功率24W，外殼采用鋁合金材質，便于散熱。光源發光中心波長520nm，帶寬10nm，該光源被放在下樣品正下方，光源面與樣品平面平行，光軸經過光源中心，入射角為~64°，計算得到照明數值孔徑NA=0.9。剛好與尼康100倍（平場消色差物鏡，NA=1.25）顯微物鏡數值孔徑匹配。無限遠顯微成像光學系統使用一臺標準透射式的明場顯微鏡（Nikon80-i）機架來搭建。使用高速灰度CMOS相機（Andor，Zyla4.2P）對樣品進行拍攝。機械樣品位移臺中樣品托架采用懸臂式結構如圖2所示，樣品被固定在一端，為保證水平需要在另一端調整配重，保證z軸位移臺受力平衡。樣品托架選擇重量輕、機械強度高的鈦合金作為制作材料。高精度z軸向位移臺使用納米級z軸位移臺（PIHeraPiezoLinearStage，P-621.1CD），閉環總調節范圍100μm，精度0.4nm。樣品為未染色的硅藻固定裝片。設置拍攝位置，照明模式按照上半環LED燈點亮，拍攝得到圖像I1如圖4（a）所示，上半環LED燈熄滅，下半環LED燈點亮，拍攝圖像得到圖像I2如圖4（b）所示，根據公式差分相襯顯微圖像Id=（I1-I2）/（I1+I2），計算出差分相襯顯微圖像如圖4（c）所示，可以看到經過計算后的圖像中硅藻結構更加清晰了。

3.2暗場顯微成像

實驗中采用的環形LED陣列光源、無限遠顯微成像光學系統、機械樣品位移臺與3.1節差分相襯顯微成像實驗中完全相同，為實現暗場成像，采用20倍尼康物鏡（平場消色差物鏡，NA=0.4）。設置拍攝位置，照明開啟全部LED燈進行拍攝，樣品為未染色的草履蟲固定裝片。

4結論

本文簡要介紹了一種基于環形LED陣列光源搭建的顯微成像系統，并根據設計方案搭建了實驗成像系統，拍攝了兩種模式的成像結果，驗證了設計方案的可行性。

作者：馬驍 顏曉萌 單位：廣東交通職業技術學院