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【摘要】目的細胞培養是現代生物技術中最核心、最基礎的技術。目前細胞生物學實驗課程對原代細胞分離培養技術培訓不足。因此文章設計了實驗以進一步提高醫學生細胞培養技能。方法分離4～6周齡雄性ICR小鼠骨髓細胞，在體外使用含有巨噬細胞集落刺激因子的RPMI1640培養液培養七天，于第三天更換培養液一次，第七天通過乳膠珠吞噬實驗檢測細胞吞噬能力。結果小鼠原代骨髓單核細胞經巨噬細胞集落刺激因子誘導一周后，分化為巨噬細胞，同時該細胞具有吞噬能力。結論通過實驗，學生掌握了相關實驗技能；加深對相關理論課程的理解；科研能力及綜合素質得到有效提升。

【關鍵詞】細胞生物學；課程設計；細胞原代培養；小鼠骨髓巨噬細胞；細胞分化；細胞吞噬

細胞培養是現代生物技術中最核心、最基礎的技術，已成為醫學院校學生未來從事臨床或科研工作的必備技能之一[1-2]。目前，我系已在長學制臨床專業及基礎醫學專業的細胞生物學實驗課程中開設了“細胞培養”實驗課程。通過該實驗，學生學習、掌握了細胞培養技術的基本知識。但目前，實驗課程中開展的細胞培養實驗主要針對已建系細胞的傳代培養，對原代細胞分離、培養技術培訓相對不足。為了進一步提高醫學生原代細胞培養技能，在充分考慮本科生的知識水平和實驗操作能力、以及我校實驗教學中心具備的實驗教學條件后，我們設計了“小鼠骨髓巨噬細胞分離培養及細胞吞噬能力檢測”綜合性實驗，于體外分離培養小鼠骨髓單核細胞，使用巨噬細胞集落刺激因子誘導單核細胞分化為巨噬細胞，并檢測巨噬細胞的吞噬能力。通過本實驗，希望可以使學生學習和掌握無菌操作技術；學習和掌握骨髓單核-巨噬細胞細胞原代培養的基本方法；了解細胞原代培養的一般方法與步驟；掌握細胞分化、細胞吞噬的基礎知識。

1材料與方法

1.1實驗動物與主要試劑

普通ICR雄性小鼠1只，4~6周齡；RPMI1640培養液（9mL）；PBS緩沖液（10mL）；青霉素/鏈霉素（5000U/mL，0.1mL）；胎牛血清（1mL）；巨噬細胞集落刺激因子（100μg/L）；乳膠珠（直徑3μm，10μL）。

1.2儀器設備

超凈工作臺（泰斯特，CJ-2D）；37℃、體積分數5%CO2細胞培養箱（Thermo，HERAcell150i）；顯微鏡（Olympus，CKX41）。

1.3實驗教學程序

本實驗為綜合性實驗，共持續兩周。其中，第一周實驗內容為小鼠骨髓單核-巨噬細胞的分離及純化；第二周實驗內容為巨噬細胞吞噬能力的檢測。將學生分為兩人一組進行實驗操作。具體教學程序設計如下：

1）每次課前安排學生預習任務。在課前要求學生復習并熟悉細胞培養基本知識及操作，了解巨噬細胞、細胞吞噬相關基礎知識，從而進一步鞏固學生相關理論知識，為實驗課程的開展打下良好基礎。同時，可適當安排預習作業，由教師指導學生查閱與本實驗課程內容相關的文獻，通過教師和學生的共同分析、討論后明確巨噬細胞分離純化、細胞吞噬能力檢測的方法。

2）結合學生預習情況，教師將實驗基本原理、實驗目標、實驗內容、時間安排等對學生做總體介紹。使學生明確不同實驗階段需進行哪些實驗操作，達到哪些目標，取得哪些結果。為達到最佳教學效果，于第一周著重介紹原代細胞培養、巨噬細胞相關知識；第二周講解細胞吞噬的檢測方法。

3）小鼠骨髓巨噬細胞的提取、純化及誘導分化。ICR小鼠經頸椎脫臼法處死后，分離雙側下肢骨，將骨髓用PBS緩沖液沖至15mL離心管中，1200r/min離心5分鐘，棄上清，沉淀用PBS緩沖液洗兩次，最終獲取的骨髓細胞用含體積分數10%胎牛血清、體積分數1%青霉素/鏈霉素、100μL巨噬細胞集落刺激因子的RPMI1640培養液重懸，并按3×106個/皿接種于直徑60mm的細胞培養皿中，置于細胞培養箱中培養，于培養第三天更換細胞培養液一次，第七天進行后續實驗[3]。同時，將未加入巨噬細胞集落刺激因子培養的細胞作為對照組，比較誘導分化及未誘導分化的小鼠單核-巨噬細胞形態。

4）巨噬細胞吞噬實驗。取第一周制備的小鼠骨髓原代巨噬細胞，于顯微鏡下觀察細胞狀態。每皿加入10μL乳膠珠，37℃孵育1小時，棄培養上清，使用4%多聚甲醛固定細胞，自來水洗去未吞噬的乳膠珠后，于顯微鏡下觀測巨噬細胞對乳膠珠的吞噬，并通過細胞計數計算吞噬乳膠珠的細胞比例。

5）討論與總結。全部實驗結束后，要求學生撰寫實驗報告一份，并與教師進行討論。要求內容詳實，結果部分需包括原代細胞的形態及細胞吞噬能力檢測相關結果。分析討論中需根據實際情況記錄在實驗過程中遇到的問題及解決方法，以培養學生獨立思考、發現問題、解決問題的能力。

2結果

2.1可獲得的實驗結果

小鼠原代骨髓單核-巨噬細胞貼壁生長，經巨噬細胞集落刺激因子誘導后，細胞呈梭型，并伸出大量偽足，符合巨噬細胞形態，表明小鼠骨髓單核細胞分化為巨噬細胞。同時，可見細胞內有大量被吞噬的乳膠珠，表明小鼠原代骨髓巨噬細胞具有吞噬能力，見（圖1）。

2.2對學生能力的培養

通過本實驗，學生將掌握小鼠原代骨髓單核-巨噬細胞的制備及純化方法；掌握細胞吞噬的檢測方法；加深對相關理論課程的理解；科研能力及綜合素質得到有效提升。

3討論

3.1開展本實驗課程的必要性

如前文所述，細胞原代培養技術是現代生物學技術的重要組成部分，已成為醫學生未來從事科研工作的必備技能。而目前的細胞生物學實驗課程體系中，由于條件所限，對相關技能培養較少。而本實驗的開展將對學生的科研能力、創新能力以及綜合素質的培養具有重要作用。首先，通過本實驗課程，既可提高學生的細胞培養技術水平，也對學生掌握相關理論課程知識具有良好的促進作用，調動學生參與科研工作的積極性。其次，本實驗課程共為時兩周，實驗內容環環相扣，任何一個環節的失誤都有可能導致實驗的失敗，因此可在本課程中培養學生在長期實驗中的耐性和專注度、及嚴謹、認真、負責的科研精神。最后，在本實驗課程的實施過程中，由教師指導學生查閱相關研究領域最新研究進展，并通過充分的討論分析確認實驗方案，通過這一過程，可培養學生查閱匯總文獻信息、發現問題、解決問題的能力；并且，教師可在此過程中向學生適時介紹我國科學家在相關領域的重大發現，使學生們認識到人類在科技探索中所展現出的毅力與熱情，更重要的是展現我國改革開放以來醫學領域的巨大進步與變化，增強學生的民族自信心。本實驗的開展也將幫助學生進一步加深相關理論知識的理解。巨噬細胞是機體免疫系統的重要成員之一，包括游離于血液中的單核-巨噬細胞以及定植于體腔和各種組織器官內的巨噬細胞。成體內的單核-巨噬細胞主要起源于造血干細胞，在骨髓中分化發育。最終，骨髓單核細胞在巨噬細胞集落刺激因子等多種生長因子的誘導下分化為成熟巨噬細胞。在體內，巨噬細胞主要通過吞噬、清除異物或衰老損傷的細胞以及分泌炎癥因子，發揮呈遞抗原、抗感染、抗腫瘤、免疫調節等重要的病生理功能。近年來，巨噬細胞在腫瘤、組織損傷及纖維化、代謝相關疾病、自身免疫病等多種疾病過程中的作用越來越受到人們的重視，已成為相關領域研究者的重要研究課題之一[4-7]。細胞吞噬是巨噬細胞重要的基本生理活動之一，巨噬細胞主要通過該過程發揮清除外源病原體、受損細胞和細胞碎片的作用。細胞吞噬即細胞內吞外源性顆粒物的過程，是受到精密調控的復雜細胞行為，該過程包括細胞對吞噬顆粒物的識別、細胞內信號的轉導、細胞骨架重塑、細胞膜變形、溶酶體消化外源性顆粒物等。因此，在細胞生物學理論課教學過程中，在細胞膜、細胞骨架等多個章節的教學內容均會涉及細胞吞噬的相關知識。因此，本實驗的開展也將為學生今后的科研工作打下堅實理論基礎。

3.2可行性分析

我系與我校實驗教學中心相配合，已在多年的教學工作中成功開展了細胞培養實驗[8]，有扎實的前期工作基礎，在實驗條件上無困難。同時，參與本實驗的教師均受過良好的細胞生物學、分子生物學教育及訓練，具有扎實、豐富的相關理論知識和實驗技能，在多年的教學工作中積累了大量的經驗，可以圓滿完成本實驗的教學工作。

綜上所述，在本科生教學過程中設計“小鼠骨髓巨噬細胞分離培養及細胞吞噬能力檢測”綜合性實驗，使學生原代細胞培養技能得到進一步提高，也增強了學生對巨噬細胞、細胞分化發育、細胞吞噬等相關細胞生物學基礎理論知識的深入理解。通過本綜合性實驗課程，教師可提高學生發現問題、解決問題的能力，開闊學生思維，培養學生正確的科研價值觀和科研素養，同時本實驗課程的開展也為學生今后開展臨床、基礎科研工作奠定了堅實基礎。

作者：李麗英 常娜 單位：首都醫科大學基礎醫學院