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【摘要】食品生物技術是高校食品相關專業的一門十分重要的專業課程，是專業性強且多學科交叉的綜合性學科。由于課程技術原理和內容較多且復雜，導致教學效果并不理想。為了提高學生的學習興趣和對知識的綜合運用能力，本文以食品生物技術課程的核心內容基因工程為主，設計實踐課程內容，以激發學生的學習興趣，提高學生的綜合、創新和創造能力。

【關鍵詞】食品生物技術；實踐；設計

1前言

生物技術是當今高科技領域發展最快、最引人注目的前沿學科之一。食品生物技術是生物技術在食品領域的重要運用，是食品相關專業教學的重要內容[1]。通過運用生物技術來對食品進行生產或改造，可提高食品產值，改善食品品質，提升農副產品附加值，對推動農業產業化發展和食品安全提供了保障[2]。《食品生物技術》作為一門綜合性學科，包括基因工程、細胞工程、酶工程、蛋白質工程、發酵工程、生物工程下游技術及現代食品檢測技術等主要內容[3]，涉及內容廣，綜合性強，學習難度大[4]。由于缺乏實踐教學的設計，學生對理論課知識的認知仍然欠缺，理論聯系實際的能力不足，所以需要開展食品生物技術的綜合型探索性實踐課程，以激發學生學生的興趣和積極性，幫助學生更加全面了解和掌握該課程中涉及的理論知識和技術原理，鞏固專業知識基礎,完成理論課知識的驗證，最終提高學生的綜合、創新和創造能力[5]。本文根據我們食品生物技術課程實踐教學設計成功經驗，從提高學生學習興趣及實踐能力，以及提高學生的創新意識的角度，以食品生物技術的核心內容基因工程作為實踐課程設計的內容，為食品生物技術實踐教學設計提供一些思路，為食品生物技術這門課程的講授提供參考。

2基因工程實驗設計

2.1實驗目的

掌握與基因工程基本操作步驟有關的實驗技能：熟悉基因組DNA、質粒工具載體的提取方法，DNA濃度的測定方法，聚合酶鏈反應（polymerasechainreaction，PCR），限制性內切酶與DNA的消化，瓊脂糖凝膠電泳，DNA連接與TA克隆及感受態細胞的轉化及利用α互補篩選細菌克隆的方法。

2.2儀器與試劑

材料：過夜培養的含質粒大腸桿菌菌液100mL，大腸桿菌感受態細胞，未線性化的細菌質粒100µL，具有T突出的T-載體，正向引物（5'-AGAGTTTGATCCTG⁃GCTCAG-3'）；反向引物（5'-GGCTACCTTGTTAC⁃GACTT-3'），試管，培養皿若干。試劑：無水乙醇，TE緩沖液（10mmol/LTris•HCl（pH8.0）、1mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA）（pH8.0）），LB液體培養基，瓊脂，瓊脂糖粉，CyberSafe染料，DNAmarker，限制性酶EcoRI，T4DNAligase連接酶，70%乙醇，超純水，溶液I（50mmol/L葡萄糖、25mmol/LTris•HCl（pH8.0）、10mmol/LEDTA（pH8.0）），溶液II(等體積的0.4mol/LNaOH和2%SDS），溶液III（5mol/L乙酸鉀60mL、冰乙酸11.5mL、水28.5mL），氯仿，苯酚，70%乙醇，胰RNA酶，青霉素（Amp），IPTG溶液，X-gal溶液，1×TBE溶液等。儀器：超凈工作臺，PCR熱循環儀，恒溫水浴鍋，臺式離心機，漩渦混合器，移液槍（10µL、100µL、1000µL），微量分光光度計，瓊脂糖凝膠電泳系統，凝膠成像儀和恒溫水浴鍋。

2.3實驗步驟及內容設計

2.3.1煮沸法提取革蘭氏陰性細菌的基因組DNA

用移液槍取1mL大腸桿菌培養物于1.5mLEP管中，14000rpm離心5min，收集菌體。加入500µLTE緩沖液，渦旋混勻。14000rpm離心1min，棄上清液。加入200µLTE緩沖液，渦旋混勻后置于100℃水浴箱中煮沸15min。取出后立即放置于冰上冷卻5-10min。14000rpm離心1min，取上清液150µL于新EP管中，此即為該細菌的基因組DNA。

2.3.2堿裂解法分離質粒DNA小量制備法

[6]在微型離心管中加入1.2mLLB培養液，14000rpm離心30s。移去上清，將沉淀用100µL含有4mg/mL溶菌酶的溶液I重新懸浮。在旋渦混合器上將細胞振蕩混勻，在室溫下放置數秒。室溫下加入200µL溶液Ⅱ，輕微振蕩試管使用其混合。加入150µL冰冷的溶液Ⅲ，上下顛倒混合。室溫孵育2min后出現白色絮狀物，14000rpm離心2min，將上清液移至新的EP管中，加入等體積的苯酚∶氯仿（1∶1）混合物，旋渦混合1min，14000rpm離心2min，將上層水相移入新的離心管中。加入等體積氯仿溶液，旋渦混合振蕩30s。14000rpm離心2min，將上層水相移入新的離心管中。加入2倍體積的冰冷的無心乙醇，混合后于-20°C沉淀5min。14000rpm離心4min，棄去上清，用冰冷的70%的乙醇淋洗沉淀，并放置在超凈工作臺中通風20min以使沉淀干燥。將沉淀重新懸浮在50µL50µg/mLRNA酶的TE緩沖液中，37°C恒溫箱保溫5min。

2.3.3使用微量分光光度計測定DNA濃度

打開NanoVue微量分光光度計電源開關。抬起金屬臂，用擦鏡紙蘸蒸餾水輕輕擦凈光導纖維終端小孔表面，合上金屬臂。先測量空白對照，校準系統。然后重復上面的操作，測量實際待測樣品。記錄濃度及A260/A280數值。

2.3.4聚合酶鏈反應（PCR）

將所有試劑冰上融化，將PCR管至于冰盒上。按照表1的體系，在PCR管依次加入試劑。按照表2設定PCR熱循環儀。

2.3.5限制性內切酶與DNA的消化

從-20°C冰箱中取出細菌質粒樣品溶液。在PCR管中加入下列試劑：7µL超純水，2µLEcoRI10×緩沖液，1µLEcoRI，10µL質粒DNA溶液。在微量離心機上離心2-3s，然后放入PCR熱循環儀，設定37°C運行2小時。反應完成后，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測產物酶解情況，觀察并記錄條帶數量和位置。

2.3.6瓊脂糖凝膠電泳

取1g瓊脂糖，加入100mL1×TBE，用微波爐加熱至溶解，將瓊脂糖溶液冷卻至50°C左右時，用移液槍加入2µLCyberSafe染料，輕搖以混勻溶液，將瓊脂糖溶液緩緩倒入插有齒梳的電泳槽模子。待瓊脂糖凝固后，取出齒梳，并放入含有TBE緩沖液的電泳槽。樣孔加入混合的1µL上樣緩沖液和5µLDNA樣品。設置100V、30min后，將膠從電泳槽中取出，置于凝膠成像儀的玻璃板上，紫外燈下觀察，并拍照記錄。

2.3.7DNA連接與TA克隆

在PCR管中加入20µL連接反應體系：lµL25µL/mL擴增的靶DNA，20ng具有T尾巴的質粒，lµL10X連接緩沖液，lµLT4DNA連接酶，補足超純水至20µL反應體系。打開PCR熱循環儀，設定程序，將連接混合物于恒定16°C反應12小時。

2.3.8感受態細胞的轉化及利用α互補篩選細菌克隆

首先制備LB篩選平板，稱取LB肉湯粉末，加入1.5%的瓊脂，溶于100mL去離子水，置于高壓滅菌鍋121°C，15min。待冷卻至50°C左右，在超凈臺中導入平板中。待涼至室溫且凝固后，吸取40µL2%的X-gal溶液，使用無菌涂布器將溶液涂至整個平板表面，待平板表面無殘留液體，吸取7µL20%的IPTG溶液涂至整個平板表面。從-80°C冰箱取出感受態細胞，小心置于冰上。用移液槍頭小心加入10µL重組質粒DNA溶液加入到200µL感受態細胞溶液。迅速放置于42℃的恒溫水浴中熱擊90s，然后冰上冷卻1-2min，向試管中加入800µL室溫下的LB培養基，37°C水浴培養45min。取200µL細胞混合液涂至含AMP的LB瓊脂培養基上，37°C培養12-16小時。觀察菌落顏色。

2.4實驗結果記錄及分析討論

實驗實施過程中，學生應如實記錄實驗結果。本部分實驗結果如圖1和圖2所示，PCR擴增應出現目標清晰條帶（圖1）。感受態細胞的轉化及利用α互補篩選細菌克隆實驗平板出現白色和藍色菌落（圖2）。實驗結束后，學生應完成實驗報告的撰寫。實驗報告內容應包括實驗名稱、目的、材料及設備、方法及步驟、實驗結果及總結和討論部分。討論部分主要是對實驗結果的準確性進行判斷，結合實驗基本原理對造成實驗失敗的可能原因進行分析和總結。

3實驗教學的實施

本門實踐課程由于涉及大量的實驗原理，需要在教學前給與學生充分的時間（可為至少1個月）進行查閱文獻資料，理清實驗基本原理、實驗思路、目的及方法，并能夠聯系到食品生物技術的理論學習部分，進行舉一反三，對于存疑的部分應和同學及教師進行探討，保證實驗前對實驗內容有較清晰的認識。在實驗實施過程中，實驗教師應提前制備所需的試劑和準備好必要材料（培養皿、移液槍、無菌槍頭等）。由于本實驗涉及到微生物和要運用一些重要儀器，因此實驗前還應對學生進行本實驗相關內容培訓，以確保實驗正常、安全、有序的實施，包括實驗室安全，微生物的無菌操作，移液槍的使用方法，儀器設備（滅菌鍋、水浴鍋、PCR儀和凝膠成像系統等）的操作規范等。在實驗實施過程中，學生應按照實驗步驟進行各項實驗，且如實記錄各部分實驗結果。如遇到實施問題，應及時與實驗老師進行溝通。教師應注意學生的實驗操作手法，避免或減少實驗操作不當，以提高實驗結果的可靠性[7]。

4考核評價標準

本門課程的實踐課程的設計旨在提高學生對理論課基本原理的認知，因此實驗課程部分可占食品生物技術這門課總成績的30%。實驗課總成績可設置為100分，實驗報告占50%，實驗操作占40%，團隊互助占10%[7]。實驗報告撰寫內容是否清晰和完整，體現了學生對食品生物技術課程基本原理的認知程度及主動學習能力，因此是主要的考核標準。其次，微生物相關的基本實驗操作技能是本門課程需要掌握的關鍵實驗技能，也是實驗實施的關鍵部分，此部分的考察是在實驗實施過程中教師實時給與的。最后，在實驗實施過程中，難免會遇到各種各樣問題，學生應依靠團隊互助掌握解決問題的辦法，在此過程中，學生發現問題并解決問題的能力得到充分鍛煉，此部分作為學生的激勵分值。

5結束語

本文針對食品生物技術的核心知識點基因工程，設計系列實驗內容，貫穿了基因工程基本原理和技術所需步驟。該實驗所需實驗條件容易滿足，項目內容完整，緊密聯系了課程所教授的理論知識，能激發學生的學習興趣，為學生后續的生物技術的理解和掌握奠定了基礎，并鍛煉了本科生查閱文獻和運用已掌握的食品生物學基礎知識及實操技能來進行深入探索和解決食品食品領域實際問題。教學后發現，這一講授設計方案可有效提高學生學習興趣，促進學生查閱大量資料并參與教師的課題研究，為未來從事食品領域提供了良好的基礎。

作者：李麗麗 陳洵 石磊 單位：暨南大學食品安全與營養研究院