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一、穩定碳同位素分析方法

目前常用的穩定碳同位素測定方法有：質譜法、核磁共振法和光譜法，其中質譜法是穩定同位素分析中最通用、最精確的方法。穩定同位素質譜分析法是先使樣品中的分子或原子電離，形成各同位素的相似離子，然后在電場、磁場的作用下，使不同質量與電荷之比的離子流分開進行檢測。穩定同位素質譜儀不僅能用于氣體，也可用于固體的研究，能用于幾乎所有元素的穩定同位素分析。近年來，隨著生物地球化學元素循環研究的發展，借助同位素質譜（EA－IRMS），多用途氣體制備及導入裝置－同位素質譜（GasBenchII－IRMS）及痕量氣體預濃縮裝置－同位素質譜（PreCon－IRMS）聯用技術的興起，碳穩定同位素的研究有了更快的發展。穩定同位素質譜儀測定同位素比率大致分3個步驟（見圖2）：（1）樣品的收集、制備和前處理；（2）將材料轉化成具有所測元素的純氣體，（3）進入質譜儀檢測。

一般樣品通過前處理后，同位素質譜聯用裝置可以完成后續的氣體轉化和測定。通常，穩定同位素質譜儀在計算機輔助下直接給出同位素比值，更先進的儀器已可以進行自動化分析，如美國熱電公司的Thermosci－entificMAT253，德國元素公司的Isoprime100穩定同位素質譜儀等。植物和土壤等固體樣品，在進行同位素質譜分析之前必須進行干燥、粉碎、稱量等處理。如果采集的土壤樣品中含有無機碳，在干燥前應該進行酸處理。制備好的樣品稱量后通過固體自動進樣器送入到元素分析儀－同位素質譜（EA－IRMS）進行碳氮同位素測定。測定土壤樣品中碳酸鹽δ13C的樣品稱量后放入樣品管，置于GasBenchII儀的恒溫樣品盤中通過酸泵滴加100％磷酸，生成的CO2氣體通過氣體自動進樣器送到同位素質譜進行碳同位素測定。

液體樣品包括土壤DOC和微生物生物量碳（MBC）等浸提液在進行同位素質譜分析之前要進行分離轉化、冷凍干燥等前處理。其中土壤DOC和微生物MBC按照參考文獻方法用0．05mol／LK2SO4溶液提取，浸提液經冷凍離心濃縮或者凍干機干燥獲得的粉末稱量后通過固體自動進樣器送入到元素分析儀－同位素質譜（EA－IRMS）進行碳氮同位素測定。氣體樣品包括空氣和培養富集氣體，用已抽真空的頂空樣品瓶采集，其中CO2氣樣需采集20～30mL，樣品中的碳同位素比值可直接通過多用途氣體制備及導入裝置－同位素質譜聯用儀（GasbenchII－MS）測定。對于空氣中的CH4需采集100～150mL，樣品中的C同位素比值可通過帶有全自動氣體預濃縮裝置－同位素質譜聯用儀（如，美國熱電公司的PreCon－IRMS）測定。

二、穩定同位素技術應用

土壤是地球表層最為重要的碳庫也是溫室氣體的源或匯，但對關鍵過程及其源或匯的研究卻十分有限。隨著全球變化趨勢的日趨明顯，農田生態系統在碳素的吸收、轉移、貯存和釋放過程中所起的作用越來越受到人們的關注。農田土壤碳的動態變化和循環特征及其微生物驅動機理研究，成為當今生態學、生物地球化學和環境科學研究的共同熱點。

1.穩定同位素技術與Keeling曲線法

土壤呼吸是農田土壤碳循環的重要組成部分，也是其排放CO2到大氣中的主要途徑。土壤呼吸以根系呼吸和土壤微生物呼吸為主。利用微氣象法能夠測定生態系統CO2通量，但是不能精確量化和區分根系呼吸和土壤微生物呼吸作用。應用穩定碳同位素技術，通過脈沖標記法（13C－CO2標記示蹤）和持續標記法（自然豐度或FACE），造成根呼吸和土壤微生物呼吸CO2碳同位素組成的差異，然后分別測定土壤總呼吸、土壤微生物呼吸和根呼吸的δ13C值，追蹤土壤呼吸的來源，并根據碳同位素質量守恒原理即可區分根系呼吸和土壤微生物呼吸，定量土壤呼吸中根系呼吸和土壤微生物呼吸的比例。目前用于測定土壤呼吸CO2碳同位素組成的取樣方法包括靜態箱（KeelingPlot）法、靜態箱平衡狀態法和動態箱連接紅外分析儀法等，其中靜態箱法相對比較成熟，而且成本低廉。Buchmann和Ehleringer采用靜態箱研究了冠層尺度C3（紫花苜蓿）和C4（玉米）作物光合作用和土壤呼吸通量及其δ13C同位素組成變化規律，通過土壤有機碳及土壤呼吸的δ13C同位素組成差異，區分了輪作系統土壤呼吸及作物光合作用對凈通量的貢獻。隨著靜態箱方法經過不斷的修改和完善，通過Keeling曲線法測得的農田生態系統呼吸釋放CO2的碳同位素組成（δ13C）能夠反映作物土壤根系和微生物呼吸釋放CO2的δ13C同位素組成，以較好地理解生態系統的同位素鑒別。

2.土壤有機碳來源及其周轉規律研究

2.1C3／C4植物變遷自然豐度法

碳、氮、氧、氫這些輕元素在自然環境中的循環和周轉過程中，其同位素比值間的差異較大，同位素分餾效應比較明顯，利用13C／12C、15N／14N、18O／16O和D／H同位素豐度比的變異攜帶有環境因素的信息，具有原位標記特性。通過測定土壤或者植物中δ13C，可以研究植物－土壤生態系統碳來源及其周轉規律。穩定碳同位素比值（δ13C）分析方法在土壤有機質分解程度評估、土壤有機質來源探討、C3／C4植被變化歷史研究等領域中得到日益廣泛的應用。由于不同植物類型具有不同的δ13C值，C3植物δ13C的變化范圍為－9‰～－17‰。；C4植物δ13C的變化范圍為－10‰～－22‰，當C3植物被C4植物所取代時就會導致土壤有機質δ13C值的改變。因此，可以通過土壤有機碳δ13C值相對于參考土壤（未改變種植作物的土壤）的變化來探討土壤有機碳的周轉速度，及不同C3和C4植物來源碳占土壤碳庫各組分及氣體CO2中的比例。Balesdent和Mariotti最早通過C3和C4植物類型的變遷來研究土壤碳庫各組分的穩定性及周轉規律，研究發現，長期耕種小麥（C3作物）的農田土壤在連續13年種植玉米（C4作物）后，22％的土壤有機碳獲得了更新，而且不同粒徑土壤有機碳的周轉速率不同，其中＞50μm和＜2μm團聚體中含有更多的新碳，而粘粒中土壤有機碳的更新速度最慢。

Dignac等通過C3和C4植物類型變遷長期定位試驗，采用銅氧化法結合穩定同位素質譜分析技術進一步研究了植物根系殘留物（木質素）的穩定性及其對土壤有機碳庫的貢獻，結果發現，連續9年種植玉米（C4作物）對土壤有機碳含量、木質素及其生物降解程度（分解和周轉）雖未產生顯著影響，但其碳同位素組成發生了顯著變化，其中有機碳中9％而木質素有47％來源于玉米（C4作物），木質素大分子的周轉速率較土壤有機碳庫更快。作為土壤碳庫中的活性組分，MBC的穩定性和周轉速率也可以通過土壤碳自然豐度δ13C值的變化進行研究。Blagodatskaya等通過54d室內培養實驗研究了C3和C4植物類型的變遷后各碳組分的周轉速率、新老碳對土壤有機碳（SOC）、微生物碳（MBC）和CO2氣體的貢獻以及微生物在碳分餾過程中的作用。研究結果發現，土壤SOC及MBC的周轉時間分別為16．8年和29～30d，而且隨著種植年限的增加，周轉時間將會延長。新老碳庫對SOC、MBC和CO2氣體的貢獻不同，其中MBC中20％碳來源于老碳（C3），CO2氣體中60％來源于老碳（C3），由于微生物對土壤老碳的偏好利用，土壤中SOC中新碳貢獻將逐年增加。13C自然豐度法靈敏度和分辨率較低，而且C3／C4植物更替，限制了應用。

2.2穩定碳同位素示蹤法

碳的穩定同位素（13C）示蹤技術能有效地闡明地下碳動態變化和土壤碳儲量的微小遷移與轉換，以及定量化評價新老土壤有機碳對碳儲量的相對貢獻。利用13C標記秸稈研究作物秸稈、殘茬或作物根系在土壤中的分解動態或對土壤有機質的貢獻，可為闡明土壤碳轉化過程及土壤肥力演變過程提供新的技術支撐。以植物殘體形式輸入的作物光合碳對土壤有機碳庫的貢獻及轉化規律已有大量的研究。竇森等在室內培養條件下，研究了添加13C玉米秸稈后，土壤有機碳庫中胡敏酸和富里酸含量隨時間的動態變化，發現在培養期間內，原有土壤有機碳較新形成的有機質的分解速度慢；同時也證明該方法用于研究短期培養條件下新加入有機質在土壤中的分解動力學是可行的。

隨著同位素技術的發展和應用，研究者開始了對生育期內植物—土壤體系中碳分配的量化研究，定量化評價根際沉積對土壤碳儲量的相對貢獻。比如，Li－ang等通過13C穩定同位素培養試驗研究了玉米根際沉積碳在土壤碳庫中的分配，認為水溶性有機碳（DOC）和MBC是“新碳”的主要去向。而Yevdokimov等的研究表明燕麥根際沉積碳的主要去向為MBC、呼吸碳和SOC，而土壤DOC并不主要來源于“新碳”。何敏毅等應用13C示蹤技術研究表明，玉米在其生育期內輸入到地下的總碳量為4．6t•hm－2，其中42％存在于根系中，7％轉化為土壤有機碳，剩下的41％通過根際呼吸進入大氣。不同研究結果的差異可能由于不同學者采用的研究方法、作物及土壤類型不同造成。

3.穩定同位素探針技術（SIP）

農田系統是半開放的人工系統，進入土壤的新鮮有機物質包括自然歸還的植物殘體和根系分泌物、人為歸還的有機肥等，而系統碳輸入是影響土壤有機碳動態的最主要因素之一。土壤微生物是土壤有機質、土壤養分轉化和循環的動力，是土壤有機質轉化的執行者。外源有機質（“新碳”）進入礦質土壤基質后，發生由微生物介導的物理–化學–微生物的轉化過程。“新碳”輸入土壤，經土壤微生物作用轉化為有機質，影響土壤有機碳含量及其組分的變化，或轉化為CO2和CH4等氣體返回大氣。應用同位素示蹤技術結合微生物分子生物學技術（PLFA／DNA／RNA－SIP）能夠定量化“新碳”在土壤碳庫中的轉化動態及其對土壤碳儲量的相對貢獻，闡明微生物種群結構與“新碳”轉化及穩定性之間的關系。Lu等用13CO2對水稻進行脈沖標記，通過13C－PLFA圖譜分析發現，不同根際微生物對植物光合作用產物有不同的吸收特征，證明了水稻根際微生物種群與植物光合作用密切相關。進一步對土壤13C－DNA進行分析，發現水稻ClusterIArchaea類群的核糖體RNA中含有13C，表明此類細菌可能在由植物碳源產生甲烷的過程中起重要作用，對全球氣候變化具有重要影響。

Bastian等定量研究了土壤外源添加小麥秸稈后，參與秸稈分解過程的（共168d，8個時間點）微生物種群結構動態變化，結果發現在秸稈降解的前期（14～28d）和后期（28～168d）細菌和真菌群落結構差異明顯，這主要是秸稈降解過程中養分由豐富向貧瘠轉化誘導的微生物r選擇和k選擇的結果。另外，農田土壤除作物光合碳根際輸入外，還存在大量的光合自養微生物，通過卡爾文循環固定大氣CO2合成有機物，并轉化為土壤有機碳，對農田土壤有機碳累積的貢獻不可忽視。而農田土壤中參與了“新碳”的輸入、分配與轉化的主要微生物種群，及其與“新碳”轉化的相互關系如何，有待進一步研究。SIP能夠將功能和種群分類聯系起來，在微生物生態學研究中有著巨大的應用潛力，隨著可用底物種類的增加（N、H），SIP技術將有可能鑒定出更多在碳、氮及其他元素循環中發揮重要作用的微生物。

三、展望

穩定碳同位素技術已在土壤有機質的轉化、土壤中碳素的來源及其影響因素等方面得到了較廣泛的應用。然而，我國農田土壤碳同位素研究大多集中于對C3和C4植物碳同位素、土壤CO2和土壤有機碳的同位素組成的測定與分析，對于農田土壤管理方式以及土壤質地、溫度等環境條件對土壤碳周轉過程的影響機理研究還很少。另外，土壤微生物是土壤有機質和土壤養分轉化和循環的動力，是土壤有機質轉化的執行者，但有關微生物種群結構和數量與農田土壤碳轉化及穩定性之間的關系尚知之甚少。因此，有以下幾方面的問題有待進一步的研究：

（1）利用13C自然豐度法和示蹤技術相結合，定量土壤有機碳的周轉速度，確定土壤有機碳的來源，深入研究不同農田管理方式對農田土壤碳素累積和轉化的影響；

（2）分析土壤13C有機碳富集的基本機制、闡明土壤13C豐度與植被類型、土壤溫度、質地之間的關系，進一步評價不同農田生態系統碳貯存潛力；

（3）通過穩定碳同位素示蹤結合微生物分子生物學技術，探討農田土壤有機碳周轉的微生物分子機理。綜上所述，我國農田土壤碳循環過程的穩定同位素技術研究還處于探索發展階段，有許多關鍵問題有待解決。隨著穩定同位素分析儀器品種的增加、自動化程度的提高和分析方法的不斷完善，該研究領域將會進入一個全面發展的新階段。

作者：袁紅朝 李春勇 簡燕 耿梅梅 許麗衛 王久榮 單位：中國科學院亞熱帶農業生態過程重點實驗室 湖南農業大學生物科技學院