前言：中文期刊網精心挑選了微生物的多樣性范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。

微生物的多樣性范文1

關鍵詞 人工濕地;桐花;海桑;木欖;微生物;種類;數量

中圖分類號[TE99] 文獻標識碼A 文章編號 1674-6708(2010)26-0097-02

0 引言

人工濕地是由人工基質和生長在其上的植物組成,形成一個獨特的基質――植物――微生物生態系統,將微生物和植物的凈化能力結合在一起,成為一個高效的凈化系統,它在保護生態環境和節約能源及投資方面具有傳統二級生化處理技術難以比擬的優點,作為一項低投資、低能耗、低運行費、高生態環境效益的治理工程技術,它越來越多地受到社會的關注和歡迎。本文通過對人工濕地基質微生物類群數目進行了研究,為進一步深入研究人工濕地凈化污水的機制提供了可能。

1 材料和方法

1.1 人工濕地概況

紅樹林人工濕地污水處理系統位于學校生物園,濕地池容積為3m×3m×0.6m(長×寬×高)。基質為石頭,上層石頭的直徑為2cm,下層石頭的直徑為1cm,厚度皆為30cm。此人工濕地為潛流型人工濕地,尚未進行污水處理。

1.2 樣品采集

采用五點采樣法,分別在人工濕地的4個角以及其中心位置采樣,深度為15cm,每個樣點取5個大小相近的小石頭,共25個。裝入無菌塑料瓶中,立即帶回實驗室,在無菌條件下加入50ml無菌水,在搖床上搖勻,制備懸液。

1.3 微生物計數

所有微生物均采用28℃恒溫培養。

1.3.1 細菌數量測定

利用牛肉膏蛋白胨瓊脂培養基進行培養,取稀釋度為10-5的懸液接種,2次重復,每一平板滴加0.05ml懸液,培養2d~3d。

1.3.2 真菌數量測定

采用馬丁氏培養基平板表面涂布法,取原液接種,2次重復,每一平板滴加0.1ml懸液,培養5d。

1.3.3 放線菌數量測定

采用改良高氏1號合成培養基平板表面涂布法,倒平板時在無菌條件下每300ml培養基加另外滅菌的3%重鉻酸鉀溶液0.5ml。取原液接種,2次重復,每一平板滴加0.05ml懸液,培養5d。

1.3.4 硝化細菌、亞硝化細菌、反硝化細菌數量測定

懸液配置成5個梯度,分別為103、104、105、106、107,3次重復,每一試管接種1ml懸液。培養7d。采用MPN法,進行顯色測定。測定方法如下:

硝化細菌:先用格利斯試劑測定,若不呈紅色,再用二苯胺試劑測試;若呈藍色,表明有硝化作用。

亞硝化細菌:用格利斯試劑測定,若有亞硝酸存在呈紅色,證明有亞硝化作用。

反硝化細菌:用格利斯試劑及奈氏試劑測定有無亞硝酸和氨存在,若其中之一或二者均呈正反應,均表示有反硝化作用。若格利斯試劑為負反應,再用二苯胺測試,亦為負反應時,表示有較強的反硝化作用。

2 結論

2.1 樹植物中三大菌群的數量特征

試驗條件下,處理污水前的人工濕地中紅樹植物基質中微生物三大種類構成為細菌、放線菌、真菌。細菌是土壤微生物中數量最多的一個類群。他們共同協作構成互利共生的系統,發揮整體作用凈化污水。

從表1可以看出,細菌在數量上占絕對優勢,桐花、海桑、木欖人工濕地污水處理系統細菌數量分別為2.05×108cfu/g(基質)、2.63×108cfu/g(基質)、2.06×108cfu/g(基質);放線菌數量分別為9.30×102cfu /g(基質)、14.8×102cfu /g(基質)、8.20×102cfu /g(基質);真菌分別為1.20×102cfu /g(基質)、2.15×102cfu /g(基質)、3.65×102cfu /g(基質)。可以推斷, 桐花、海桑、木欖對微生物的種類和數量具有某種選擇作用。

出現此類現象的原因如下:

1)微生物的生態分布與各類微生物的生物學特性有關。一般情況下,細菌喜歡濕潤,能耐受低氧水平;真菌耐干,不能耐受低氧水平;放線菌具有喜熱耐旱的特性,只有當各類微生物競爭的壓力減少時才出現,因而處于厭氧條件下的人工濕地中的微生物主要由細菌組成。

2)在紅樹林生態系統中也有出現放線菌、真菌數量稀少的現象,這也可能是其中一個原因,但對其機制尚未弄清,而且紅樹林生態系統處于潮間帶,其土壤生境兼有海洋與陸地的性質而又不同于它們,與人工濕地的生境不相同,因此,對于兩種系統會出現相似現象的原因尚待進一步研究和探索。

2.2 硝化細菌、反硝化細菌的數量特征

從表2可以看出,桐花、海桑、木欖人工濕地污水處理系統中反硝化細菌數量分別為1.65×104MPN/g(基質)、9.1×104MPN/g(基質)、77.90×104MPN/g(基質);硝化細菌數量分別為2.75×102MPN /g(基質)、5.0×102MPN /g(基質)、10.79×102 MPN/g(基質);亞硝化細菌數量為0.75×102MPN /g(基質)、2.82×102MPN/g(基質) 、1.30×102MPN /g(基質)。反硝化細菌數量多于硝化細菌和亞硝化細菌。其原因如下:1)通常硝化細菌是自養型好氧微生物,依靠NH4+-N 和NO-2的氧化獲得能量生長,需要氧氣作為呼吸的最終電子受體。反硝化細菌在缺氧和低溶解氧條件下利用有機物的氧化作為能量來源,以NO-3和NO-2作為無氧呼吸時的電子受體。所以,厭氧條件下的人工濕地中反硝化細菌繁殖快,生長迅速,硝化細菌繁殖慢,生長緩慢;2)硝化自養菌是專性化能自養細菌,它包括硝化細菌和亞硝化細菌兩個亞群,硝化作用由兩個階段組成(階段一:2NH4++3O2NO2-+2H2O+4H+,階段二: 2NO2-+O22NO3-):在亞硝化細菌的作用下,將NH4+-N轉化成NO-2-N;在硝化細菌的作用下,將NO-2-N轉化成NO-3-N。正是由于這種生態學上的偏利互生關系的存在,使得硝化細菌的生長總要晚于亞硝化細菌。

參考文獻

[1]靖元孝,楊丹菁,陳章和,陳兆平.兩棲榕在人工濕地的 生長特性及其對污水的凈化效果[J].生態學報,2003(3).

微生物的多樣性范文2

[關鍵詞] 確定依據 自然保護區 保護范圍 外來物種引進 措施 法律制度

1992年將生物多樣性定義為:指所有來源的活的生物體中的變異型,這些來源除其他外包括陸地,海洋和其他水生生態系統及其構成的生態綜合體;這包括物種內,物種之間和生態系統的多樣性。自此,各種關于生物多樣性保護的思想和活動應運而生,其中,確定生物多樣性保護對象的范圍及其依據已經是當今理論界研究的一個熱點問題,并且成為我國生物多樣性保護立法的基礎和首要任務。

一、我國生物多樣性保護的依據

1.生物多樣性的決定因素及保護生物多樣性的目的

生物多樣性，取決于生態系統中生物鏈的穩定性。而生物鏈的穩定性又是由環境決定的, 因此,生物多樣性的狀況最終由其生存環境和整個生態系統決定。關于生物多樣性保護的目的,使物種在自然系統中充分發揮各自的作用,結構性和功能性得以保證,從而維持整個生態系統的穩定和豐富多彩。

2.生物多樣性與生態系統

(1)生物多樣性與生態系統的理論關系

目前,我國生物多樣性保護主要集中在瀕危物種上,而事實證明,我們未來的工作必然轉向生態系統功能上。保護生物多樣性的目的是為了整個生態系統的平衡和人類的可持續發展，生物多樣性的價值不僅體現在瀕危物種上，更重要的體現在生態系統和與人類的關系上。人們關心生物多樣性的喪失對人類生存的威脅，首先會注意到最易滅絕的物種上, 越是瀕危越重要,這一點是非常合理的, 然而,隨著實踐的發展,人們便會認識到物種與森林保護、濕地保護和生物圈等有著更為重要的關系生物多樣性與生態系統的平衡才是最終目標。

(2)自然保護區在生物多樣性保護中的有效性分析

自然保護區是指為了保護珍貴和瀕危動、植物以及各種典型的生態系統，保護珍貴的地質剖面，為進行自然保護教育、科研和宣傳活動提供場所，并在指定的區域內開展旅游和生產活動而劃定的特殊區域的總稱。世界各國劃出一定的范圍來保護珍貴的動、植物及其棲息地已有很長的歷史淵源，一般都把1872年經美國政府批準建立的第一個國家公園――黃石公園看作是世界上最早的自然保護區。20世紀以來自然保護區事業發展很快,目前全世界自然保護區的數量和面積不斷增加，并成為一個國家文明與進步的象征之一。截止2007年,中國也已建立各級自然保護區900多處，大家普遍認為,自然保護區在涵養水源、保持水土、改善環境和保持生態平衡等方面發揮了重要作用,特別是對瀕危,珍稀物種的繁殖、馴化貢獻尤為重大.而我認為,看到自然保護區效果的同時其負面影響也值得探討:這種保護技術雖然在短期內起到了保護物種生存的目的,但它將動物與其自然棲息地隔離開來,不同程度的干擾了生態進程, 物種與環境,物種與物種之間的演化過程就此消失,是目前生物多樣性保護的一個嚴峻挑戰.以大熊貓保護為例,建立專門的保護區使其在一定程度上回歸了自然生態環境,在人工幫助下繁衍生息,但本質仍是被保護而非自然生存狀態,它作為生態系統元素的一部分,功能并沒有得到發揮,其野性和生存能力不是加強了,而是大大減弱了,長遠看來,反而不利于其未來的發展.此外,自然保護區的經營和管理也已出現問題,主管部門較多 ,各自為政,影響了整體規劃;許多保護區由于國家和地方政府沒有提供足夠的經費，而不得不面對現實，通過各種途徑增加收入, 把開發利用保護區的旅游資源與其他生物資源作為保護區增加收入的主要途徑;部分地區由于資源緊張,還出現了居民和保護區爭奪資源使用權的現象，這些因素都影響了保護生態環境,保護物種目的的發揮,因此, 自然保護區的有效性問題至得認真商榷。

3.生物多樣性的區域性

(1)生物多樣性的區域性理論

不同的物種適應不同的地理和氣候條件,生物多樣性保護并不意味著地球上每一個角落的生物都一樣多,結構都完全相同。不同地區都有適合其條件而生長的物種,該物種在此地數量多起積極作用,在另一地方則可能相反。例如外來物種入侵問題,由于人們對物種特性的不了解,致使某個物種的引進對當地生態。系統造成了極為嚴重的破壞。由此可見,物種的區域性本身就是生物多樣性保護的一個重要方面。

(2)外來物種引進在生物多樣性保護中的有效性分析

為了生物多樣性保護工作的開展,一段時間內我們便將引進外來物種作為快速增加物種數量的重要手段,這種方法短期內看似有效,卻帶來了一個長遠和影響深刻的大問題,即外來物種入侵: 生態系統是經過長期進化形成的，系統中的物種經過上百年、上千年的競爭和適應，才形成了現在相互依賴又互相制約的密切關系。一個外來物種引入后，有可能因不能適應新環境而被排斥在系統之外，必須要有人的幫助才能勉強生存；也有可能因新的環境中沒有相抗衡或制約它的生物而成為真正的入侵者，打破平衡，改變或破壞當地的生態環境。以“紫色惡魔”的鳳眼蓮即俗稱的“水葫蘆”為例,1884年，原產于南美洲委內瑞拉的鳳眼蓮被送到了美國新奧爾良的博覽會上，來自世界各國的人見其花朵艷麗無比，便將其作為觀賞植物帶回了各自的國家，殊不知繁殖能力極強的鳳眼蓮便從此成為各國大傷腦筋的頭號有害植物。在非洲，鳳眼蓮遍布尼羅河；在泰國，鳳眼蓮布滿湄南河；而美國南部沿墨西哥灣內陸河流水道，也被密密層層的鳳眼蓮堵得水泄不通，不僅導致船只無法通行，還導致魚蝦絕跡，河水臭氣熏天；而我國的云南滇池，也曾因為水葫蘆瘋狂蔓延而被專家指稱患上了“生態癌癥”。由此可見,盲目引進外來物種,不僅不能促進生物多樣性保護工作的開展,嚴重的情況下還可能發展為一場生態災難。

二、我國生物多樣性保護的范圍

生物多樣性保護對象的范圍包括哪些,主要有兩種觀點:一種認為,保護生物多樣性就是要采取措施保護瀕危及珍稀物種,減小物種滅絕速度.另一種則認為, 保護生物多樣性，那就是保護所有生物,任何物種都不應從生態系統中消失.這兩種觀點都是片面的,確定生物多樣性的保護對象必須有科學的依據,以下兩個問題值得大家商榷:

1.是否每一個物種都應受到保護

從各類研究數字可以看出,生物多樣性保護的現狀是不容樂觀的,過去60萬年間10萬種左右的物種才消失,而現在每一個小時就會消失一種生物,物種滅絕的速度是相當驚人，自1600年以來， 人類已經導致75%的物種滅絕。由此,許多人提出,保護生物多樣性就是要保護地球上所有存在的物種,使物種的數量保持在最大數目.我認為這一點是需要認真考慮的:從進化論而言，每一個物種在長期進化過程中能保存下來，都有它的合理性.但同時,自然界也遵循自然選擇的規律,隨時淘汰那些不符合環境,地理狀況及氣候物種,達到自然狀態的最優化.生態系統中所有物種都是彼此聯系的，但它們的作用并不完全相同,某一個物種滅絕、或者瀕危，并不足以使生態系統發生根本性的改變，關鍵還要看滅絕或瀕危的是什么樣的物種,因此,保護生物多樣性并不是簡單的保護所有物種,而是要盡可能的減少人類活動對自然和環境的影響,使不該滅絕的物種降低滅絕的危險。

2.物種的保護應注重量和質的結合

目前,我國已經采取許多措施開展生物多樣性保護工作,取得了明顯效果,所建的自然保護區涵蓋了我國70%的陸地生物系統、80%的野生動物和60%的高等植物，使絕大多數珍稀瀕危野生動植物得到保護.我們在保護物種上做出的成績值得肯定,另一方面,還應該充分認識到物種質量的重要性.保護生物多樣性不單單是盲目的維持和增加物種的絕對數量,還要考慮物種的未來發展,其年齡結構必須合理,性別結構必須穩定,優勢基因必須發揚,從整體上提高物種的質量,才能適應環境的變化和生態系統本身的需求。

三 我國生物多樣性保護應采取的措施

保護生物多樣性是我國目前的一個重要任務,確定好生物多樣性保護的對象及其依據,完善相關法律制度首當其沖,我認為,實踐中應該對各個物種的情況具體分析,采取不同的保護措施:

1.就地保護:為了保護生物多樣性，把包含保護對象在內的一定面積的陸地或水體劃分出來，進行保護和管理。就地保護的對象，主要包括有代表性的自然生態系統和珍稀瀕危動植物的天然集中分布區等. 目前，全世界的生態專家已經得到一個共識，如果你要去保護野生動物，那么最好的理念就是在野生動物的家鄉、原始棲息地去保護它。比如說保護大熊貓，不是將其放在動物園里,而是將它放到保護區內更為合理。當然,待情況轉好后,大熊貓的最后歸宿不是被人們養起來,而是被放歸大自然自由生存.就地保護是現今我國最重要,涉及面最廣的一項保護措施。

2.遷地保護:為了保護生物多樣性，把因生存條件不復存在，物種數量極少或難以找到配偶等原因，而生存和繁衍受到嚴重威脅的物種遷出原地，移入到動物園、植物園、水族館和瀕危動物繁育中心，進行特殊的保護和管理。遷地保護為行將滅絕的生物提供了生存的最后機會,然而,將物種放進動物園,植物園是不是就達到最終目的了,答案是否定的,遷地保護目的是使即將滅絕的物種找到一個暫時生存的空間,待其元氣得到恢復,具備自然生存能力的時候,重新回到生態系統中,發揮應有的作用。遷地保護是就地保護的一個重要補充。

3.建立基因庫

為了保護生物多樣性,人們已經開始了一項新的計劃,建立基因庫,來實現保存物種的愿望。科技高速發展的今天，我們把各種珍稀動物的胚胎、基因冰凍起阿種措施聽起來可以解決一切問題,實踐中必須予以嚴格控制。因為它一定能夠程度上挑戰了大自然的生存規律,一旦濫用會對人類和生態系統造成無法彌補的后果。

4.為了保證生物多樣性保護工作的順利高效開展,我們必須運用法律手段,完善相關法律制度:第一,補充自然保護區制度,明確保護區的設立和管理體制。第二,建立嚴格的控制外來物種入侵制度。從維護國家和地區生態安全的角度出發,加強對外來物種引入的評估和審批,實現統一監督管理.如加強生物引種,交通運輸,國際貨物貿易等分方面的監督,建立生物引進風險評價等。第三,建立基金制度。要有效的保護生物多樣性就要有強大的經濟基礎.有關部門應建立完善的基金制度,保證國家專門撥款,爭取個人,社會和國際組織的捐款和援助,為實踐工作的開展提供強有力的財力支持。

參考文獻:

[1]孫儒泳:《生物多樣性的啟迪》[M].上海,上海科技教育出版社,2000

[2]胡嘉濱:論我國生物多樣性保護和可持續利用法律體系的重構[J].國土與自然資源研究,2006(2)

[3]陳晗霖:我國生物多樣性法律保護制度的建立和完善[J].安徽農業科學,2006(3)

微生物的多樣性范文3

【關鍵詞】環境工程;DGGE技術;廢水生物處理

1.新技術在環境工程生物處理研究中的應用

由于PCR-DGGE技術克服了傳統微生物學方法的局限性，自Muvzer等開辟了DGGE在微生物生態領域研究的先河以來，該技術迅速發展成為環境微生物群落結構分析研究的主要手段之一。近年來，DGGE 用于環境微生物種群的研究越來越多，涉及的領域也越來越廣泛，在國外DGGE技術已經被廣泛用于活性污泥、生物膜等生物處理系統中的微生物多樣性檢測、微生物鑒定以及種群演替等方面的研究，在國內這方面的應用雖然處于起步階段，但也成為研究的熱點。

1．1在廢水生物處理研究中的應用

PCR-DGGE技術在廢水生物處理研究中的應用使人們對廢水處理過程中微生物群落的變化產生了新的認識。

Lapara等研究了升高溫度對廢水好氧生物處理過程中細菌群落結構和功能的影響，DGGE分析細菌群落的結果表示不同溫度下有不同的細菌群落。

應用PCR-DGGE方法，對在相同的操作條件下分別用低溫菌和常溫菌接種的兩套活性污泥系統中的微生物群落結構的動態變化進行了追蹤。由于工藝相同，使得接種的低溫菌群和常溫菌群在相同的操作條件下，產生了相似的微生物群落結構。隨著運行時間的增加，其菌群結構相似程度也越來越高。

硝化作用是廢水處理系統中實現氨氮去除的關鍵步驟。而氨氧化細菌在硝化作用過程中負責將氨氧化為亞硝酸鹽，實現亞硝化作用，是硝化過程中必不可少的步驟。但由于氨氧化細菌的生長速率相當低，生物量很少，采用傳統的細菌分離培養分析法研究氨氧化細菌相當費時、繁瑣。許玫英等采用PCR擴增16SrDNA、擴增功能基因、隨機克隆測序等技術，分析處理含高濃度氨氮廢水處理系統不同馴化時期的4個活性污泥樣品氨氧化細菌的種類和氨單加氧酶的活性，并在國內首次采用PCR-DGGE相結合的技術對樣品中總的細菌類群的差異進行研究。結果表明采用PCR-DGGE技術有利于更全面地了解氨氧化細菌的類群和功能，進而改善廢水處理系統的處理效果。

應用PCR-DGGE技術對城市污水化學一生物絮凝強化一級處理工藝與傳統的完全混合式處理工藝反應池活性污泥樣品微生物種群結構進行了對比研究，對同一反應器不同位置微生物分布以及不同工況下的微生物種群結構進行了初步探討。結果表明兩種城市污水處理工藝中微生物種群多樣性都相當豐富，但是種群結構相差很大。說明化學生物絮凝處理工藝的微生物作用與成分相近的城市污水處理工藝中微生物作用機理可能存在相當大的差別。

R0wan等采用生物滴濾反應器和生物濾池處理同種廢水，運用PCR-DGGE考察了不同反應器中的氨氧化細菌菌群的組成。雖然不同形式反應器或是同一反應器的不同位置中的氨氧化細菌菌群組成不同，但是主要種群是不依賴反應器的形式或是在反應器中所處的位置不同而改變的，也正是這些主要種群在整個處理過程中發揮著重要的作用。

采用PcR-DGGE技術對處理采油廢水的水解酸化一缺氧法不同生物反應器中污泥樣品進行研究，確定了微生物的優勢菌種，并進行了多樣性分析，結果顯示了在不同環境條件下微生物群落結構的連續動態變化過程。

1．2 在廢氣生物處理研究中的應用

生物過濾是一種能有效處理惡臭和揮發性有機廢氣的氣體污染控制技術。生物濾池和生物濾塔作為生物處理惡臭氣體的簡單有效的方法，得到了快速的發展。

采用PCR-DGGE技術研究除臭生物濾池中試裝置中分別一處于較強酸性和中性的兩種不同運行環境下微生物種群的多樣性和生物種群的結構變化。通過擴增細菌16SrRNA基因的V3可變區，結合應用DGGE技術分析除臭生物濾池的生物種群的結構變化，并回收主要的DN段，結合PCR測序及T載體克隆測序，明確優勢菌群的系統發育地位。結果表明，除臭生物濾池在不同的口H條件下，微生物的多樣性及其豐度存在較大差別，強酸性對微生物具有較高的選擇作用，與中性條件相比 微生物種群多樣性相對較低。同時在濾池的不同層次上也表現出明顯的空間分布多樣性差異，序列比對結果顯示硫氧化細菌在除臭過程中占有優勢地位。為更好地處理惡臭氣體提供可靠的科學依據，同時也為生物除臭的應用提供一定的理論基礎。

生物濾塔中微生物的種群結構以及微生物多樣性對于惡臭氣體的處理效率以及反應器的穩定運行至關重要。殷峻等應用DGGE技術對處理含氨廢氣的生物濾塔中微生物多樣性隨時間的變化進行了研究，通過比較反應器不同填料、不同時期微生物多樣性得出結論：填料中微生物的多樣性都隨著反應器運行時間的延長而有所減少；與污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多樣性程度最高，反應器的去除能力也最好。

1．3 在污泥生物處理研究中的應用

在污泥處理過程中，污泥的穩定化是…個相當重要的過程。微生物的穩定化過程對于系統達到穩定狀態具有更直接的指導意義。傅以鋼等用DGGE指紋圖譜技術對污泥堆肥工藝中的細菌種群動態變化及多樣性進行了研究。結果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。對污泥堆肥各工藝環節樣品進行DGGE指紋圖譜和相似性系數Cs值分析，發現隨著反應的持續進行，微生態結構的Cs值越來越高，說明微生物種群結構愈趨穩定。證實污泥微生態能迅速進行優勝劣汰的篩選，調整內部細菌種群結構，從而達至 適應環境的目的，在發酵過程中形成的優勢細菌種群能長時間保持穩定。

2.技術的原理

微生物的多樣性范文4

關鍵詞：重金屬污染；土壤微生物；微生物多樣性；研究方法

中圖分類號 X172 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）13-0036-03

Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil

Li Yan1 et al.

（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）

Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.

Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods

近年來，由于農藥、化肥的大量使用，以及冶金、采礦業的迅猛發展，土壤重金屬污染日趨嚴重[1]。重金屬污染不僅會嚴重影響農產品以及農作物的品質，而且會通過食物鏈進入人體，危害人體健康。土壤是微生物棲息的最重要環境之一，提供了微生物生長所必要的營養物質。土壤微生物種類十分豐富，主要分為細菌、真菌、古菌以及放線菌等。土壤微生物是土壤有機質以及土壤養分C、N、P、S等循環轉化的動力，參與土壤中有機質的分解、腐殖質的形成、土壤養分的轉化循環等[2]。土壤微生物在土壤生態系統中扮演者十分重要的角色[3]，對環境的變化反應靈敏[4]，其群落多樣性和相對組成，是評價環境質量的重要參數[5]。一旦土壤生態系統受到污染，土壤微生物就會發生相應的變化[6]。有研究報告指出，土壤重金屬污染能明顯影響土壤微生物的活性及結構[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物對重金屬脅迫特別敏感，可通過微生物群落結構的變化來反映土壤質量和健康狀況[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意義。本文對研究微生物傳統以及各種新型研究方法進行了分類介紹，并對各種方法的優缺點以及適用場合進行說明。

1 土壤微生物研究方法

1.1 傳統的分離純培養和稀釋平板計數 在固體瓊脂培養基上接種培養微生物，可利用微生物的表面特征差異，在固體培養基上對微生物進行分離純化，也可利用該方法對微生物在平板上進行簡單的計數[10]。同時可以通過配制不同成分的培養基對微生物進行篩選馴化，從而得到我們需要的菌種。此種方法的優點是成本低，便于對微生物的狀況做出初步的判斷。缺點是由于自然界中存在大量的不可培養的微生物，且存在很多對溫度要求苛刻并微生物，如嗜低溫菌和嗜高溫菌，傳統的固體培養基的培養溫度并不能滿足這些微生物的生存所需溫度。

1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于測定微生物對單一碳源利用程度的差異來表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由對照孔和95種不同單一碳源孔組成并在其中添加染料，當接種純培養的菌液時，其中一些孔的營養物質被利用，使各孔呈現出不同的顏色，從而形成微生物特有的代謝指紋，可通過與標準菌種的數據庫做對比，從而可鑒定出被測菌種。與傳統培養方法相比，此方法可以估算微生物群落代謝多樣性和功能多樣性。同時可根據各孔的顏色差異來反映出微生物群落的均勻度，從而可以反映出群落的穩定性[12]。該方法的缺點是當環境差異不大時，這些指數并不能較敏感地區分菌群之間的差異[13]。同時由于不同的生長和競爭的結果，菌種之間會相互影響導致種群發生變化，影響測定結果[14]。

1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活細胞的細胞膜中，具有屬的特異性，不同屬的微生物通過不同生化途徑而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs組成和含量變化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的動態變化。通過對微生物的磷酸脂肪酸進行提取，并依據其中的特征脂肪酸指示的微生物種類[16]，可對土壤中微生物群落特征進行表征。此種方法具有對試驗條件要求低、無需對微生物進行培養、測試功能多和穩定性好等優點[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。該方法只能鑒定到屬，PLFA圖譜并不能給出一個實際的微生物種類組成，僅能反映微生物群落的概圖[18]；另外，該方法容易受微生物生理狀態影響[19-20]；古菌不能使用PLFA圖譜進行分析，因為它的極性脂質是以醚而不是以酯鍵的形式出現[21]。同時由于目前尚未建立土樣中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情況下，還無法確定土樣中某些脂肪酸與特定微生物或微生物群落的對應關系[22]。

1.4 變性梯度凝膠電泳技術（PCR-DGGE） 該技術是以復雜的環境樣品如土壤為研究對象，直接提取微生物DNA，利用通用引物進一步對提取的DNA進行PCR擴增。將擴增產物開展DGGE凝膠電泳分析[23]。DGGE不是將分子量不同的DNA分開，而是通過聚丙烯酰胺凝膠中變性劑濃度梯度的不同，將序列不同的DNA分開[24]。該方法的原理是根據DNA的解鏈特性，不同堿基組成的DNA雙螺旋發生變性所需要的變性劑濃度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝膠基礎上加入變性劑，根據其遷移行為決定于其分子大小和電荷的原理能夠將長度相同但序列不同的DN段區分開[25]。該方法具有可靠性高、重現性強、方便快捷、分辨率高等優點[26]，但同時也存在一定的局限性。DGGE還不能全面分析土壤中全部微生物，該方法只能檢測出土壤中相對豐度大于1%的微生物[27]；同時DGGE對實驗要求較高，凝膠濃度、溫度、電壓等電泳條件選擇不當時，就會發生共遷現象[26]，即同一條帶不止包含一種微生物，微生物的種類被低估。

1.5 高通量測序技術 高通量測序技術也稱“下一代”測序技術，1次并行能對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技術為代表[28-29]。該技術對于研究土壤微生物具有極大的意義。該技術極大地降低了微生物測序成本，實驗了大規模土壤微生物直接測序[30]；同時該方法極大地提高了測序通量，豐富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究課題。但同時該方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量數據分析難的問題，該測序方法所測數據之深，所獲信息之大，都極大地加大了實驗研究者分析數據的難度；數據去偽存真難的問題，在土壤微生物高通量測序中，存在物種豐富度被高估的情況[30]，對高通量測序結果去偽存真，探索新的統計學方法成為研究者面臨的一大難題[31]。

1.6 基因芯片技術（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技術手段，作為新一代的核酸雜交技術，可用于檢測環境微生物參與物質循環、污染物降解等過程中參與的功能基因[32]。該方法是在芯片上含有編碼各種與生態學和生物功能過程或生物降解作用有關酶的基因[33]。由此可見，功能基因芯片為土壤微生物研究提供了全新有力的技術分析工具，有利于更加有效地利用微生物對污染土壤進行修復[34]。基因芯片技術具有高密度、高靈敏度、自動化和低背景水平等顯著優點[35]。但是任何技術都存在一定的局限性，基因芯片技術也不例外。該技術雖能檢測出微生物在生物學過程中所發揮作用的功能基因，但是卻不能直接表征微生物的群落多樣性組成和豐富度。應結合DNA與mRNA測序，可以更加真實全面地反映土壤微生物群落結構信息及其生理活動[34]。同時該方法在取樣、標記、雜交條件、圖像處理、數據歸一化以及所得數據的質量評估等都會帶來很多誤差[36]。

2 不同方法在重金屬污染土壤中的應用

劉云國等[37]在湖南臨鄉桃林礦區土壤中采用稀釋涂布法在馬丁固體培養基上篩選出一株高抗銅、鋅菌株；張秀等[38]利用Biolog微平板法來分析生物質炭對鎘污染土壤微生物多樣性的影響；孫婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法來分析羥基磷灰石-植物聯合修復對Cu/Cd污染植物根際土壤微生物群落的影響；鄭涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法對鋅脅迫對土壤中微生物群落變化的影響進行了評價分析；江玉梅等[41]利用Illumina平臺高通量測序技術分析重金屬污染對鄱陽湖底泥微生物群落結構的影響；路桃香對植物非根際土壤微生物進行454高通量測序。

目前對于微生物研究方法有很多種，有最先進的技術，也有傳統的實驗方法，每種方法都各有優缺點，因此，在研究土壤微生物時，應結合土壤特征以及研究目的合理選擇研究方法。如條件允許的情況下，可以結合多種技術方法同時使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。

參考文獻

[1]高煥梅，孫燕，和林濤.重金屬污染對土壤微生物種群數量及活性的影響[J].江西農業學報，2007，19（8）：83-85.

[2]胡嬋娟，劉國華，吳雅瓊.土壤微生物生物量及多樣性測定方法評述[J].生態環境學報，2011，20（z1）：1161-1167.

[3]李椰.土壤微生物研究方法概述[J].青海畜牧獸醫雜志，2016，46（3）：51-53.

[4]蔡燕飛，廖宗文.土壤微生物生態學研究方法進展[J].生態環境學報，2002，11（2）：167-171.

[5]Macura J.Trends and advances in soil microbiology from 1924 to 1974[J].Geoderma，1974，12（4）：311-329.

[6]毛雪飛，吳羽晨，張家洋.重金屬污染對土壤微生物及土壤酶活性影響的研究進展[J].江蘇農業科學，2015，43（5）：7-12.

[7]Zhiqiang Y U.Microbial Remediation of Heavy Metal（loid）Contaminated Soil：A Review[J].Agricultural Science & Technology，2016，17（1）：85-91.

[8]李晶，劉玉榮，賀紀正，等.土壤微生物對環境脅迫的響應機制[J].環境科學學報，2013，33（4）：959-967.

[9]陳欣瑤，楊惠子，陳楸健，等.重金屬脅迫下不同區域土壤的生態功能穩定性與其微生物群落結構的相關性[J].環境化學，2017（2）：356-364.

[10]鐘文輝，蔡祖聰.土壤微生物多樣性研究方法[J].應用生態學報，2004（05）：899-904.

[11]王強，戴九蘭，吳大千，等.微生物生態研究中基于BIOLOG方法的數據分析[J].生態學報，2010（3）：817-823.

[12]胡可，王利賓.BIOLOG微平板技術在土壤微生態研究中的應用[J].土壤通報，2007，38（4）：819-821.

[13]王強，戴九蘭，吳大千，等.微生物生態研究中基于BIOLOG方法的數據分析[J].生態學報，2010，30（3）：817-823.

[14]鄭華，歐陽志云，方治國，等.BIOLOG在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應用[J].土壤學報，2004，41（3）：456-461.

[15]吳建軍，蔣艷梅，吳愉萍，等.重金屬復合污染對水稻土微生物生物量和群落結構的影響[J].土壤學報，2008，45（6）：1102-1109.

[16]于樹，汪景寬，李雙異.應用PLFA方法分析長期不同施肥處理對玉米地土壤微生物群落結構的影響[J].生態學報，2008，28（9）：4221-4227.

[17]畢明麗，宇萬太，姜子紹，等.利用PLFA方法研究不同土地利用方式對潮棕壤微生物群落結構的影響[J].中國農業科學，2010，43（9）：1834-1842.

[18]喻曼，，張棋，等.PLFA法和DGGE法分析堆肥細菌群落變化[J].農業環境科學學報，2011，30（6）：1242-1247.

[19]Widmer F，Flie?bach A，Laczkó E，et al.Assessing soil biological characteristics：a comparison of bulk soil community DNA-，PLFA-，and BiologTM-analyses[J].Soil Biology & Biochemistry，2001，33（7C8）：1029-1036.

[20]Howeler M，Ghiorse W C，Walker L P.A quantitative analysis of DNA extraction and purification from compost[J].Journal of Microbiological Methods，2003，54（1）：37.

[21]Sundh I，Nilsson M，Borga P.Variation in microbial community structure in two boreal peatlands as determined by analysis of phospholipid Fatty Acid profiles.[J].Appl Environ Microbiol，1997，63（63）：1476-1482.

[22]顏慧，蔡祖聰，鐘文輝.磷脂脂肪酸分析方法及其在土壤微生物多樣性研究中的應用[J].土壤學報，2006，43（5）：851-859.

[23]夏圍圍，賈仲君.高通量測序和DGGE分析土壤微生物群落的技術評價[J].微生物學報，2014，54（12）：1489-1499.

[24]宋洋，李柱剛.DGGE技術在土壤微生物群落研究中的應用[J].黑龍江農業科學，2010（7）：5-8.

[25]Green S J，Leigh M B，Neufeld J D.Denaturing Gradient Gel Electrophoresis（DGGE）for Microbial Community Analysis[J].2017.

[26]劉權鋼，金東淳，劉敬愛.DGGE技術在土壤微生物多樣性分析上的研究進展[J].延邊大學農學學報，2012，34（2）：170-176.

[27]Ferris M J，Muyzer G，Ward D M.Denaturing gradient gel electrophoresis profiles of 16S rRNA-defined populations inhabiting a hot spring microbial mat community.[J].Applied & Environmental Microbiology，1996，62（2）：340.

[28]Quail M A，Kozarewa I，Smith F，et al.A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.[J].Nature Methods，2008，5（12）：1005.

[29]Meyer M，Stenzel U，Hofreiter M.Parallel tagged sequencing on the 454 platform[J].Nature Protocols，2008，3（2）：267-78.

[30]Gomezalvarez V，Teal T K，Schmidt T M.Systematic artifacts in metagenomes from complex microbial communities.[J].Isme Journal，2009，3（11）：1314.

[31]樓駿，柳勇，李延.高通量測序技術在土壤微生物多樣性研究中的研究進展[J].中國農學通報，2014，30（15）：256-260.

[32]鐘毅，張旭，梁玉婷，等.基于基因芯片技術的石油污染土壤微生物群落結構[J].清華大學學報（自然科學版），2010（9）：1396-1399.

[33]He Z L，Gentry T J，Schadt C W，et al.Geochip：A comprehensive microarray for investigating biogeochemical，ecological and environmental processes.ISME J，2007，1：67C77

[34]孫寓姣，張惠淳.功能基因芯片在土壤微生態研究中的應用[J].南水北調與水利科技，2013（1）：93-96.

[35]Zhou J，Thompson D K.Challenges in applying microarrays to environmental studies[J].Current Opinion in Biotechnology，2002，13（3）：204-207.

[36]嚴春光，陳鈞輝，王新昌.基因芯片及其應用[J].中國生化藥物雜志，2006，27（5）：321-323.

[37]⒃乒，周娜，樊霆，等.銅、鋅離子抗性菌篩選及重金屬作用下富集特性研究[J].湖南大學學報（自科版），2009，36（2）：80-84.

[38]張秀，夏運生，尚藝婕，等.生物質炭對鎘污染土壤微生物多樣性的影響[J].中國環境科學，2017，37（1）：252-262.

[39]孫婷婷，徐磊，周靜，等.羥基磷灰石-植物聯合修復對Cu/Cd污染植物根際土壤微生物群落的影響[J].土壤，2016，48（5）：946-953.

[40]鄭涵，田昕竹，王學東，等.鋅脅迫對土壤中微生物群落變化的影響[J].中國環境科學，2017，37（4）：1458-1465.

微生物的多樣性范文5

關鍵詞：土壤；真菌；DNA提取；ITS-PCR；T-RFLP

中圖分類號：Q938.1+1 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2013）06-1443-04

土壤微生物是森林生態系統中最重要的組分，在凋落物分解、腐殖質合成以及養分循環等過程中起著十分重要的作用。其種類和組成不僅直接影響土壤的生物化學循環，而且是土壤生物活性的具體體現，并在森林生態系統的物質循環和能量流動中扮演著重要角色[1-3]。不同土壤分布著不同的土壤微生物，而不同的微生物多樣性又影響土壤功能的多樣性[4]。土壤微生物的組成和分布可以在深層次上揭示森林生態系統的物質循環和能量流動。目前測定土壤微生物多樣性的方法主要有稀釋平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物學方法等[5]。隨著分子生物學技術在土壤微生物研究中的不斷發展，土壤微生物多樣性的研究有了新的突破。核糖體ITS區為非編碼區，受到的選擇壓力較小，進化速度快。因此該區段能夠提供比較豐富的變異位點和信息位點，目前已經用于種間、亞種和種群水平上的遺傳多樣性研究[6]。自從Innis等[7]1990年首先設計ITS引物對真菌核內核糖體RNA基因進行擴增以來，ITS序列分析技術在真菌分類、鑒定的研究中應用越來越廣泛。

該研究利用分子生物學技術對長白山自然保護區不同森林類型的土壤真菌群落組成進行分析，比較不同植被類型與土壤真菌之間的關系及變化趨勢，以期加深對土壤真菌變化過程和機制的認識，為長白山區域天然林保護和生態建設提供基礎資料。

1 材料與方法

1.1 材料

土壤樣品于2010年10月采自長白山自然保護區（表1）。按不同林型采用對角線型混合取樣法采集表層的土壤，采集深度為0～5 cm，用塑料袋封裝帶回。-80 ℃下密封保存。

1.2 試劑與儀器

Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性內切酶Hinf Ⅰ購自寶生物工程（大連）有限公司；土壤真菌基因組提取試劑盒購自MoBio Laboratories公司；DNA純化試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR擴增儀、上海盧湘儀臺式離心機、BIO-RAD凝膠成像系統等。

1.3 方法

1.3.1 土壤樣品DNA的提取與檢測 土壤樣品DNA的提取參照MoBio土壤真菌提取試劑盒的方法。

1.3.2 ITS-PCR擴增及產物純化 用于ITS片段擴增的引物采用真菌ITS區通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，具體序列如下：ITS1-F（5′3′）：CTTGGTCATTTAGAGG

AAGTAA；ITS4（5′3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。

ITS擴增反應體系為：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反應條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35個循環；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR擴增產物經1%瓊脂糖凝膠電泳后用凝膠成像處理系統觀察拍照。

1.3.3 ITS-PCR產物的純化 采用DNA純化試劑盒，按照說明書進行PCR產物純化。

1.3.4 ITS-PCR產物的限制性酶切分析 ITS-PCR產物的T-RFLP分析反應體系為30 μL：含10 μL ITS-PCR產物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反應4 h，然后65 ℃作用20 min終止反應。將酶切產物送至上海美吉生物醫藥有限公司測序。

1.3.5 數據分析 每個T-RFLP的豐度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%計算， 其中ni代表每個可分辨的T-RFLP的峰面積， N代表所有T-RFLP峰面積的總和。種群多樣性指數[8]用BIO-DAP軟件計算。依據公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）計算樣品之間Sorenson[9，10]的相似系數， 其中NA+B指兩樣品共有的條帶數目，NA、NB指兩樣品各自包含的條帶數目。

2 結果與分析

2.1 不同森林類型土壤真菌T-RFLP分析結果

利用限制性內切酶Hinf Ⅰ對6種不同森林類型土壤真菌ITS區進行酶切，T-RFLP分析結果見圖1。從圖1可以看出，酶切譜帶清晰，RFLPs比較明顯，酶切片段在100～600 bp之間，不同森林類型真菌群落存在明顯差異。

2.2 不同森林類型土壤真菌多樣性

不同森林類型土壤真菌香農多樣性指數、均勻度見表2。由表2可知，1號樣點的香農多樣性指數最高，3號樣點的最低；1、2、3、5號樣點的均勻度高，4號樣點的均勻度最低。一般而言，多樣性越高群落穩定性大，穩定性的大小反映了多樣性的大小。植物根系可為微生物棲息提供很好的場所，植被覆蓋使得土壤濕度更適合于群落的發展，微生物群落的發展反過來又有利于植物群落的發展。

2.3 不同森林類型土壤真菌相似性

從不同森林類型土壤真菌群落結構相似性系數分析結果見表3。由于森林類型的不同，土壤的真菌群落也有較大差異，群落功能也有較大差異，甚至森林類型接近的土壤，真菌的相似性也比較低，森林土壤真菌的空間差異性很大。

3 小結與討論

3.1 土壤樣品DNA的提取與純化

如何獲得高質量的土壤樣品總DNA是分子生物學技術的基礎和關鍵[11]，只有獲得高質量的土壤樣品總DNA才能保證后續PCR擴增的準確、可靠。土樣中主要污染物為多糖、腐殖酸和酚類化合物，其中腐殖酸的理化性質與核酸相似，因此在DNA提取過程中很難完全去除，而腐殖酸等雜質會影響后續的PCR反應[12]。

3.2 土壤真菌多樣性指數

香農多樣性指數是一種評價不同土壤的微生物群落多樣性十分有效的方法，香農多樣性指數越高表明微生物群落多樣性越大，它由種類的豐富度及種類的均勻度兩部分組成[13，14]。在不同類型的森林土壤中，真菌的群落香農多樣性指數呈現出較大的差異性和復雜性，這可能是由于天然森林中的真菌的空間異質性高所致。白樺林中后期和過熟闊葉紅松林，光照充足， 干擾少， 土壤結構比較穩定， 枯枝落葉積累多， 水分涵養好， 適合微生物生長， 所以土壤真菌的類群多，土壤相對較肥沃。從整體上來看， 白樺林中后期和闊葉紅松林土壤質量高， 微生物種類多，土壤結構穩定，有利于植物的生長。

該研究對不同森林類型土壤真菌群落的變化規律進行研究， 探討了真菌群落的演替規律， 但對于真菌群落的變化規律以及微生物與植物之間如何互作還需進一步研究。同時對于其他樣點的森林類型土壤微生物群落的變化規律如何還有待進一步揭示。

參考文獻：

[1] 王銳萍，劉 強，彭少麟，等.尖峰嶺不同樹種枯落物分解過程中微生物動態[J].浙江林學院學報，2006，23（3）：255-258.

[2] 李延茂，胡江春，汪思龍，等.森林生態系統中土壤微生物的作用與應用[J].應用生態學報，2004，15（10）：1943-1946.

[3] 趙 萌，方 晰，田大倫.第2代杉木人工林地土壤微生物數量與土壤因子的關系[J].林業科學，2007，43（6）：7-12.

[4] 臧 蕾，張宗舟，藺海明.白水江自然保護區土壤霉菌數量及物種多樣性分析[J].甘肅農業大學學報，2006，41（5）：100-104.

[5] 婁 鑫，崔曉陽.溫帶森林次生演替過程中土壤微生物多樣性研究[J].土壤通報，2011，42（3）：557-561.

[6] 戴 偉，郭永軍，王曉梅，等. 3個地理居群泥蚶核糖體DNA ITS區的RFLP分析[J].安徽農業科學，2010，38（10）：4990-4991.

[7] INNIS M A， GELFAND D H， SNINSKY J J，et al. PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications[M]. New York： Academic Press，1990.315-322.

[8] 姚 斌，錢曉剛，于成志，等.土壤微生物多樣性的表征方法[J].貴州農業科學，2005，33（3）：91-92.

[9] HORSWELL J， CORDINER S J， MAAS E W， et al. Forensic comparison of soils by bacterial community DNA profiling[J]. Journal of Forensic Science，2002，47（2）：350-353.

[10] 葛蕓英，陳 松，孫 輝，等.土壤細菌群體多樣性的T-RFLP分析應用探討[J].中國法醫學雜志，2008，23（2）：104-106.

[11] RICHARD A H， QIU X Y， WU L Y，et al. Simultaneous recovery of RNA and DNA from soils and sediments[J]. Applied and Environmental Microbiology，2001，67（10）：4495-4503.

[12] TIMOTHY M S， IAN L P， CHARLES P G. Removal of PCR inhibiting substances in sewage sludge amended soil[J]. Water Science and Technology，1995，31（5）：311-315.

微生物的多樣性范文6

1試驗方法

1.1自然生物膜的培養采用以南京玄武湖湖水配置的BG11培養液［17］培養自然生物膜．采用聚氯乙烯材質的彈性立體填料(200mm×0.5mm)作為載體，該材料的添加對水質以及生物膜的生長沒有副作用;材料使用前用0.1mol/L的HCl溶液浸泡12h，并使用去離子水反復清洗，以去除雜質．生物膜的培養在盛有30LBG11培養液的透明玻璃容器中進行，容器中添加一定長度的彈性立體填料［18］．培養過程中，在容器口處用空隙尼龍網包扎以防止昆蟲以及其他雜物落入．保持水位不變，并定期觀察生物膜長勢情況．試驗期間溫度保持在20～38℃之間．

1.2自然生物膜對染料的凈化試驗試驗先進行自然生物膜的擴大培養，即在自然光照的條件下利用BG11培養液于溫室下進行靜態培養．掛膜2個月左右后，彈性立體填料表面形成致密的深綠色生物膜，生物膜長勢成熟，生長旺盛．剪取每段長約20cm且掛有生物膜的彈性材料，置于5L的玻璃容器中，并設立試驗組和對照組．其中，試驗組中ρ(RhB)為0.5mg/L，對照組不添加RhB，每組設3個重復．試驗過程中，每天定時采集水樣，用聚醚砜微孔濾膜(孔徑0.45μm，濾頭直徑1.3cm)過濾，采用紫外可見分光光度計(UV2450，島津公司，日本)測定ρ(RhB)，做好相關記錄．采樣測試試驗共進行11d，當試驗組中ρ(RhB)處于較低水平(水質較清澈)后試驗結束．

1.3PLFA法測定微生物群落多樣性微生物PLFA的提取參照Bligh-Dyer修正方法［19］，以酯化C19∶0為內標，提取、純化、分析測定流程:取2g干燥生物膜，加20mL氯仿－甲醇－檸檬酸緩沖液(體積比為1∶2∶0.8)直接抽提樣品的總脂肪酸，提取的總脂肪酸經硅膠柱(SPE-SI)分離為中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸;其中磷脂酸溶于甲醇－甲苯(體積比為1∶1)溶液，加入10mL0.2mol/LKOH，37℃下酯化15min，用GC-MS(gaschromatograph-massspectrometry，sturn，Varian，美國)分析儀進行不同分子的分離;采用PLFA標準譜圖(bacterialfattyacidstandards)和美國商品化的MIDI系統(microbialidentificationsystem)來識別與定量PLFA．

1.4Biolog法測定微生物功能多樣性Biolog方法是通過檢測樣品中微生物對Biolog公司生產的微孔板中的31種不同碳源利用情況來反映微生物群落水平的生理輪廓(communitylevelphysiologicalprofiles，CLPP)，以AWCD(averagewellcolordevelopment，顏色變化率)顯示微生物群落對不同碳源代謝的總體情況，其變化速率反映了微生物的代謝活性，最終的AWCD與微生物群落中能利用單一碳源的微生物的數目和種類有關［20］．Biolog法測定微生物功能多樣性采用Eco微孔板(BiologHayward，CA，USA)，每塊板有96個孔，分為3組，可以同時完成3個重復．每組32個孔，其中第1個孔不含任何碳源，作為對照，其余31個孔各含有1個單獨的碳源和四氮唑藍．具體操作:準確稱取相當于5.00g干質量(按含水量換算)的生物膜，置于滅菌的45mL生理鹽水(0.85%NaCl)中，室溫下180r/min振蕩30min后取出，靜置5min得到生物膜懸液;在超凈工作臺中吸取生物膜懸液1mL置于19mL事先滅菌的生理鹽水中進行稀釋;將稀釋后的生物膜懸液接種于Eco微孔板中，每孔150μL，每樣1板(為3次重復)，置于25℃暗箱連續培養，分別于24、48、72、96、120、144h在590nm下測定OD值．每個樣品的AWCD的計算方法［21］:AWCD=［∑31i=1(Ci－R)］/31式中:Ci為第i個反應孔的OD值;R為對照孔的OD值．另外，主成分分析及碳源利用分析均選用72h的OD值進行計算．

1.5數據統計方法采用MSExcel2007和Origin8.0對數據進行統計和繪圖;采用SPSS16.0中的Duncan法和DateReduction程序分別對數據進行差異顯著性分析和主成分分析．

2結果與討論

2.1凈化效果由圖2可見，自然水體生物膜對RhB染料具有一定的去除效果．隨著時間的增加，ρ(RhB)持續降低．在染料添加的第1天，RhB的去除率達到了29.2%，之后幾天每d的去除率降至3.9%左右，測試期內總去除率為68.6%．第1天RhB去除率較高的原因可能是吸附在凈化過程的開始階段起到重要作用，吸附過程速率較快［3］．之后幾天仍保持一定的RhB去除率可能與生物吸收降解以及光降解有一定關系［22］;但是對照試驗證明，該條件下光照對RhB的降解影響較小，總去除率約7.3%，因此，在該試驗的采樣期間光降解作用可以忽略．WU等［10］對相關的研究報道進行了綜述，指出微生物聚集體對污染物質的去除機理主要有吸收、降解和吸附作用．自然生物膜作為一種微生物聚集體，其對RhB的凈化機理也可能包含了吸附作用、吸收和降解作用．康春莉等［23］研究證明，自然生物膜中的胞外聚合物的含量占總有機質的80%以上，并且自然生物膜表面存在著大量的陰離子基團(如羧基、羰基等)，這些電負基團對陽離子型污染物質具有靜電吸附作用．Solis等［24］綜述了近幾年真菌、細菌和藻類在染料廢水脫色降解中的作用和效果，并指出利用微生物進行染料脫色和降解是經濟有效的方法．真菌、細菌和藻類均可以降解部分染料，特別是有些白腐真菌的脫色能力已有了大量的研究結果．Maulin等［25］分離出可以降解偶氮染料的細菌，并發現在pH為6，溫度為37℃時該菌對染料的去除率達80%以上．自然生物膜作為一種典型的微生物聚集體，含有大量的真菌、細菌和藻類，其中部分微生物可能對染料具有一定的凈化和降解效果;然而環境中的pH、溫度、含碳量和含氮量都可能會影響凈化效果，從而使得自然生物膜對RhB的去除效果仍處于較低水平．

2.2環境掃描電鏡(ESEM)觀察采用Quanta200環境掃描電鏡對自然生物膜在處理RhB廢水前后進行ESEM(environmentalscanningelectronmicroscope，環境掃描電鏡)掃描攝像，結果如圖3所示．由圖3可見，對照組生物膜外表面比較光滑，界限分明，表面大量的絲狀物主要為藻類;添加RhB10d后的生物膜邊界處較為粗糙，并且呈網狀結構，原本界限分明的絲狀物出現了增生．究其原因，可能是RhB這種酚類化合物接觸了自然生物膜上的微生物，與微生物細胞的蛋白發生化學反應，從而對微生物產生毒性脅迫，誘使其在表面分泌某種物質，進而與RhB結合，或將其隔離于細胞體外來達到自我保護的目的．楊翠云等［26］研究表明，微囊藻毒素對大腸桿菌和枯草芽孢桿菌具有一定的脅迫作用，細胞通過調節細胞內可溶性蛋白和可溶性糖的含量來抵抗外界脅迫，但隨著處理時間的延長，細菌逐漸適應了這種脅迫，恢復正常的生長．李淑英等［27］研究表明，Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+對大薸根際微生物的影響，隨微生物區系或生理類群和重金屬脅迫濃度的不同而不同，Hg2+對放線菌、細菌、真菌的毒性最強，Pb2+次之．

2.3RhB對自然生物膜微生物群落結構特征的影響PLFA法通過測定微生物膜上的脂肪酸片段結構，分析微生物群落結構和生物量在不同環境中的變化．因為不同類群微生物含有的PLFA種類和數量均不相同，即PLFA和微生物類群數量之間存在著對應的關系，因此該技術常被應用于微生物生態學的研究中，以定量描述土壤、底泥及海水等生境中微生物的群落結構［28-29］．該研究采用PLFA法對微生物生物量以及各菌群進行分析，將試驗得到的生物膜微生物磷脂脂肪酸量進行統計分析，可以判斷出微生物群落結構多樣性．PLFA以“總碳數∶雙鍵數ω雙鍵距離分子末端位置”命名;前綴a和i分別表示支鏈的反異構和異構，cy表示環丙烷脂肪酸;后綴c表示順式脂肪酸，t表示反式脂肪酸;10Me表示一個甲基側鏈在距分子末端第10個碳原子上．不同PLF段對應的微生物群落如表1［30-31］所示．試驗結果見表2。由表2可見，對照組的總PLFA含量大于試驗組，說明RhB的添加對生物膜微生物的生物量有一定的影響．RhB的添加使自然生物膜微生物的總PLFA含量減少52.23%，使細菌、真菌和放線菌的數量分別減少了75.81%、67.03%、100%．其中，放線菌幾乎消失，這可能是由于放線菌對染料的毒害性更受敏感所致．李淑英等［27］研究發現，微生物對Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+的敏感性表現為放線菌＞細菌＞真菌．但是，自然生物膜中的微生物并未完全被破壞，仍保持一定的數量和種類．為了獲得更多可靠信息，不考慮相對含量低于1.0%的單體PLFA，對其余含量較高的PLFA進行主成分分析，提取的前2個主成分的累積貢獻率達83.66%，其中PC1(第一主成分)的貢獻率為61.06%，PC2(第二主成分)的貢獻率為22.60%，分析結果如圖4所示．由圖4(a)可見，試驗組與對照組對于自然生物膜微生物群落PLFA的影響區分較明顯，其中，試驗組微生物主要表現為與PC2相關的微生物種類，而對照組微生物主要表現為與PC1相關的微生物種類．由圖4(b)可見，革蘭氏陽性菌的特征脂肪酸(如i15∶0、i17∶0)及放線菌的特征脂肪酸〔如17∶0(10Me)〕在PC1上載荷值較高，說明PC1是它們的代表因子．a16∶0、14∶0是表征革蘭氏陽性菌的脂肪酸，在PC2載荷值較高，可以認為PC2是它們的代表因子．綜上，RhB對自然生物膜上革蘭氏陽性菌和放線菌影響的差異較明顯．

2.4微生物群落功能多樣性添加RhB不僅影響了自然生物膜上微生物的群落結構和數量，也影響了其活性．由圖5(a)可見，在0～24h內，對照組和試驗組的微生物群落的AWCD均較低或只有輕微增加;24～48h內2種微生物群落的AWCD隨時間表現出幾何級數增加;48h至培結束(144h)，2種微生物群落的AWCD隨時間的增速趨于緩慢直至達到平衡．無RhB添加的對照組AWCD始終大于試驗組，表明接觸了RhB的生物膜微生物利用單一碳源的能力減弱了．究其原因，生物膜上的有機質可能與RhB相互作用，降低了其生物有效性［32］．為研究生物膜微生物群落碳源利用多樣性的特點，以培養72h的樣品為例，對Biolog測試數據進行標準化變換后用于主成分分析，結果見圖5(b)．其中，PC1的貢獻率為23.59%，PC2的貢獻率為18.37%．由圖5(b)可見，對照組和試驗組表現出了明顯的分布差異．Garland等［21］認為，各樣本在空間上位置的不同是和碳底物的利用能力相關聯的．具體而言，各樣本在主成分空間不同軸上的差異是與聚集在該軸上碳源的利用能力相聯系的．因此，在RhB的影響下，自然生物膜微生物群落對31種碳源的利用表現出了差異，說明其活性受到了影響．但是這種影響是否對自然生物膜有利尚需進一步判斷．另外對與PC1和PC2具有較高相關性的6個碳源進行分析，結果如表3所示．由表3可見，在PC1上載荷較高的6種碳源中，有3種氨基酸、2種碳水化合物、1種多聚物;在PC2上載荷較高的6種碳源中，有3種碳水化合物，羧酸、多聚物和酚酸類各1種，說明影響PC1和PC2的碳源以碳水化合物為主．綜上，使自然生物膜微生物群落代謝多樣性表現出差異的主要碳源為碳水化合物類，其次為氨基酸類．

3結論