前言：中文期刊網精心挑選了分子生物學進展范文供你參考和學習，希望我們的參考范文能激發你的文章創作靈感，歡迎閱讀。

分子生物學進展范文1

【關鍵詞】齲病；牙菌斑；口腔細菌；代謝產堿

【中圖分類號】R780.2

【文獻標志碼】A

牙菌斑生物膜是定植于牙表面的微生物群落，其與宿主防御之間存在著動態平衡，且與定植部位相適應。牙菌斑生物膜的細菌組成和代謝與齲病和牙周病關系密切。牙菌斑生物膜中糖源物質的攝入，致變異鏈球菌和乳桿菌等菌群產酸和耐酸菌并過度生長形成優勢菌群，牙菌斑內pH迅速下降至臨界值，從而引起牙齒脫礦。過去普遍認為，細菌產酸是齲病發生的直接原因。有學者認為，牙菌斑生物膜中耐酸菌比例的增加和口腔非耐酸性益生菌比例的減少是導致齲病的重要原因。當下的研究卻發現，大部分的口腔益生菌都具有精氨酸脫亞氨酶系統（arginine　deiminase　system，ADS）或者尿素酶系統，可利用精氨酸或尿素為底物產堿，細菌代謝產堿可積極地調控牙齒脫礦與再礦化之間的平衡，阻止產酸和耐酸菌形成優勢菌群，從而防止致齲性牙菌斑生物膜的形成。

研究顯示，齲病與口腔微生物的產堿能力降低密切相關，調控牙菌斑生物膜中細菌代謝產堿的能力可作為一種有潛在應用前景的防齲策略。隨著細菌代謝產堿的能力與齲病呈負相關性的結論不斷地得以證實，越來越多的研究者開始關注牙菌斑生物膜中細菌代謝產堿的細菌學和分子生物學等基礎和臨床研究。本綜述著重介紹口腔細菌代謝產堿的分子生物學研究進展，為未來的研究方向提供線索。

1　生物膜中細菌代謝產堿的主要途徑

牙菌斑生物膜中細菌代謝產堿最主要的兩大途徑包括尿素酶和ADS。尿素在健康人群口腔中的濃度為3～10mmol·L-1，主要來源于唾液和齦溝液。尿素在口腔中可以被細菌尿素酶迅速分解并產生氨、二氧化碳和水。具有尿素酶活性的細菌包括唾液鏈球菌和內氏放線菌以及口腔嗜血菌屬等。相對于尿素，精氨酸在口腔中的平均濃度僅為50μmol·L-1。精氨酸可以被細菌ADS分解代謝為鳥氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸（adenosine　triphosphate，ATP）。與尿素分解代謝不同的是，精氨酸代謝還為細菌提供了ATP，因此賦予了細菌額外的生長能量優勢。多種口腔微生物均具有ADS，包括血鏈球菌、格氏鏈球菌和副血鏈球菌以及某些種類的乳桿菌屬細菌和螺旋體。

精胺代謝是口腔中的另一條堿代謝途徑。與尿素和精氨酸代謝相比較，精胺代謝酶活性較弱。精胺是精氨酸在細菌精氨酸脫羧酶作用下產生的中間代謝產物，也可來源于一些食物。精胺在牙菌斑生物膜和唾液中的濃度分別為0.75和0.2mol·L-1。精胺在細菌鯡精氨酸脫亞氨酶系統（agmatine　deiminase　system，AgDS）的作用下產生腐胺、氨、二氧化碳和ATP。該系統與ADS具有高度同源性。基因組分析和功能研究表明，AgDS存在于包括變異鏈球菌、表兄鏈球菌、汗毛鏈球菌、大鼠鏈球菌、鏈球菌、緩癥鏈球菌和倉鼠鏈球菌以及唾液乳桿菌和短乳桿菌在內的眾多口腔細菌中，其中大量的細菌與齲病密切相關。目前在所有具有AgDS的細菌中，僅大鼠鏈球菌、血鏈球菌和唾液鏈球菌等益生菌同時具有ADS和尿素酶系統。

2　生物膜中細菌代謝產堿與齲病的關系

有報道稱，慢性腎功能衰竭患者唾液中的尿素水平較健康人高50倍，即使高糖飲食，其患齲率明顯低于健康人群。Nascimento等發現：無齲人群的牙菌斑整體堿活性明顯高于齲活躍人群；成年人非齲易患者唾液中的尿素酶活性是齲易患者的3～5倍，牙菌斑中的精氨酸脫亞氨酶活性是齲易患者的2倍。有報道稱，兒童非齲易患者的牙菌斑尿素酶活性是齲易患者的2倍，唾液尿素酶活性是齲易患者的3倍，而且牙菌斑精氨酸活性是齲易患者的2倍。還有報道稱，在牙膏或漱口液中加入精氨酸類化合物可降低人群的齲失補牙指數。上述研究均表明，牙菌斑生物膜中的細菌代謝產堿水平與齲病的發生呈負相關性。

3　生物膜中細菌代謝產堿的分子生物學研究

3.1尿素酶

口腔細菌代謝產堿途徑的分子生物學研究最早開始于尿素酶，以前的綜述中已經有詳細的介紹。尿素酶是一種含鎳的低聚物酶，編碼尿素酶的7個基因排列成操縱子結構，ureC、A、B基因翻譯產生α、β和γ三個亞基組成（αβγ）3結構，ureDEFG編碼的輔助蛋白用于鎳離子的整合和酶的激活。在有關口腔細菌尿素酶的研究中，唾液鏈球菌和內氏放線菌尿素酶的生物學特性及其基因表達調控的研究最為深入。這兩種細菌的尿素酶有許多相似之處，均受多種環境因素的影響。以內氏放線菌為例，其尿素酶的活性在酸性環境下和有大量糖類物底物時增強，同時其酶活性也依賴于環境中氮源底物的量。值得注意的是，這些因素均與齲病密切相關；因此，Burne等提出當宿主處于患齲高風險時，唾液鏈球菌和內氏放線菌的尿素酶能夠為防止齲病的發生發揮積極的作用。

3.2精氨酸脫亞氨酶系統

原核生物中廣泛存在著ADS，該系統酶具有保守的一級結構。編碼ADS的多個基因通常排列組成操縱子結構，但是其基因的排列順序在不同的細菌間存在著差異。arcA基因負責編碼精氨酸脫亞氨酶，這種酶可水解精氨酸生成瓜氨酸和氨。arcB基因編碼一種分解代謝性鳥氨酸氨甲酰基轉移酶，可將瓜氨酸轉化為鳥氨酸和氨甲酰磷酸。位于arcB基因下游的arcC基因編碼一種分解代謝性的氨甲酸酯激酶，后者可將氨甲酰磷酸的一個磷酸基團轉移給腺苷二磷酸，從而生成ATP、二氧化碳和氨。此外，許多具有ADS的細菌，其操縱子中還存在一種編碼精氨酸和鳥氨酸反向轉運蛋白的arcD基因；精氨酸氨肽酶和相關轉錄調控子也是由ads基因簇中的基因編碼。在具有ADS的細菌中，格氏鏈球菌是唯一由精氨酸脫亞氨酶arc操縱子與queA基因相連并共轉錄的細菌，這種基因被預測編碼一種修飾tRNA的S－腺苷甲硫氨酸：tRNA核糖轉移酶異構酶，后者與ADS轉錄調控子arcR共轉錄。

目前，已有眾多關于口腔鏈球菌和非口腔細菌ads基因調控機制的研究報道。在口腔細菌中，ads基因的組成和調控研究主要集中在格氏鏈球菌、血鏈球菌和大鼠鏈球菌。雖然，ADS在不同細菌中的表達均受到多種環境因素的調控，如pH值、糖源、氧分壓和精氨酸等，但是細菌間調控模式和機制卻不完全相同。以格氏鏈球菌為例，其ADS主要受精氨酸和低pH值誘導，但是碳源性分解代謝物阻遏和高氧分壓對精氨酸脫亞氨酶活性可產生抑制。這些環境因素對ADS的調控主要作用在轉錄水平，環境因素的調控作用主要通過多種調控蛋白質和多個雙組分系統的交叉協同作用來實現。精氨酸對ADS　arc基因轉錄的誘導作用主要通過ArcR進行調控；酸性環境誘導arc基因轉錄主要通過ArcR以及VicRK、CiaRH和ComDE的共同作用；碳源性分解代謝物對ADS的阻遏作用，則是通過宏觀調控碳代謝蛋白質（carbon　catabolite　protein　A，Ccp-A）實現的；高氧分壓的環境信號則通過Fnr樣蛋白Flp與雙組分系統VicRK的協同作用，實現對精氨酸脫亞氨酶轉錄的抑制。此外，QueA對arc基因轉錄的影響整體表現為抑制作用，可能與影響了ads基因或其調控基因的轉錄效率有關。細菌間相互作用，如格氏鏈球菌在與內氏放線菌細胞共聚集的狀態下，細菌內源性精氨酸的生物合成被激活，也可導致ADS的活性增強。

3.3鯡精氨酸脫亞氨酶系統

AgDS并非如ADS那樣在微生物細胞中廣泛存在。除部分口腔細菌以外，目前只在糞腸球菌、銅綠假單胞菌、蠟狀芽孢桿菌、希氏乳桿菌和幽門螺桿菌等少數幾種細菌中發現了AgDS。與ADS一樣，AgDS的基因也通常以aguBDAC操縱子的形式排列。精胺依靠一種精胺－腐胺反向轉運蛋白D（agmatine-putrescine　antiporter　D，AguD）進入細胞，并在aguA基因編碼的鯡精氨酸脫亞氨酶作用下水解為N－氨甲酰腐胺和氨，而N－氨甲酰腐胺又經aguB基因編碼的腐胺氨甲酰基轉移酶代謝生成腐胺和氨甲酰磷酸。最終，aguC基因編碼的氨甲酸酯激酶將氨甲酰磷酸的一個磷酸基團轉移給腺苷二磷酸，從而生成ATP、二氧化碳和氨。腐胺可以在反向轉運蛋白作用下交換細胞外的精胺。agu基因的轉錄調控子由位于agu操縱子上游相反方向的aguR基因編碼。

盡管AgDS的活性在口腔鏈球菌中存在著較大的差異，但其總體活性明顯低于細菌ADS和尿素酶系統；盡管在變異鏈球菌和大鼠鏈球菌中檢測到的AgDS與ADS的活性相似，但倉鼠鏈球菌和表兄鏈球菌AgDS卻較其ADS的活性低50倍以上。在所有口腔細菌的AgDS活性當中，關于變異鏈球菌AgDS的研究最為深入細致，變異鏈球菌AgDS對細菌生長及耐受環境壓力有著重要的意義。研究顯示，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶缺陷株的生長速度明顯慢于野生株。Burne等也曾報道，當變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶活性表達受到抑制時，其耐受酸、氧氣和超氧化物的能力明顯降低。

變異鏈球菌AgDS的活性表達受到細菌生長和多種環境因素的影響，其影響主要作用于細菌鯡精氨酸脫亞氨酶的轉錄水平。變異鏈球菌AgDS的表達同時依賴外源性底物精胺的供給。在僅有10mmol·L-1外源性精胺供給的情況下，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達可增高5倍。外環境pH值也是影響變異鏈球菌精胺脫亞氨酶表達的重要因素之一。劉婭玲等利用口腔恒化器模型研究發現，在pH5.5的酸性環境下，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達水平是pH7.0的中性環境下酶活性的3倍；同時，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達水平與細菌生長環境中的氧分壓密不可分。氧氣對變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的表達具有明顯的抑制作用，當變異鏈球菌在無氧條件下培養時，其鯡精氨酸脫亞氨酶的表達是有氧培養條件下的3倍。

變異鏈球菌的AgDS活性依賴于細菌的生長周期，變異鏈球菌的AgDS在細菌對數生長早期表達較低；隨著細菌進入對數生長中期，其酶活性表達逐漸增高；當細菌生長到達靜止期時，其酶活性表達最高。此外，熱刺激效應也可促進變異鏈球菌的AgDS活性表達。變異鏈球菌在44℃的條件下生長，其AgDS的活性表達是37℃條件下的2倍。變異鏈球菌AgDS的基因表達亦受到碳源性分解代謝產物的抑制。作為典型的抑制性糖源，葡萄糖對變異鏈球菌的AgDS具有較強的抑制作用；而當半乳糖作為糖源時，變異鏈球菌鯡精氨酸脫亞氨酶的活性是葡萄糖作為糖源培養條件下的5倍。

在變異鏈球菌中，眾多環境因素對AgDS的調節作用是通過多種調控通路的交叉以及多種調控蛋白質的交互作用來完成的。研究顯示，AguR作為agu操縱子的主要調控蛋白質，參與低pH和底物精胺對AgDS的調控作用。劉婭玲等發現：AguR是一種位于變異鏈球菌細胞膜中的跨膜蛋白質，包括4個跨膜結構域，蛋白質C-末端可能位于細胞內；AguR蛋白在激活時會產生變構裂解，最終與agu操縱子結合啟動agu的轉錄。除此之外，AguR調控蛋白與AguD精胺轉運蛋白的相互作用是調控agu轉錄的關鍵。在低pH值和精胺存在的條件下，AguR調控蛋白可與AguD精胺轉運蛋白發生交互作用，從而誘導AgDS的表達。AguR與精胺結合導致AguR的變構激活，從而促進AguR與其靶標agu操縱子結合。酸性環境有利于AguR形成合適的蛋白質構型，使其對靶DNA的信號轉導更加高效。在缺乏外源性精胺的情況下，AguR與AguD的相互作用可能會阻止AguR與其底物或靶標的結合。該項研究結果對闡明AgDS的調節機制具有重要意義。除AguR和AguD以外，其他多種宏觀調控蛋白和雙組分系統也都同時參與了對變異鏈球菌AgDS的調控作用。CcpA和CcpB作為主要的碳源性分解代謝物阻遏調控蛋白，是不同碳源底物調節AgDS轉錄的主要調控蛋白。包括CiaRH、ComDE和VicRK在內的多個雙組分系統都共同參與了低pH條件下AgDS的誘導，而且CiaRH同時也是變異鏈球菌感受外界熱刺激效應下AgDS優化表達的重要調控因子。目前，雖然有研究例證實雙組分系統之間存在交叉調控和串話現象，但外界環境信號是通過怎樣的具體途徑傳導誘導AgDS表達仍需深入研究。

分子生物學進展范文2

[關鍵詞] 早期宮頸癌；復發；分子生物學

[中圖分類號] R737.33 [文獻標識碼] A [文章編號] 2095-0616（2013）10-39-03

宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤。宮頸癌死亡率每年大約26萬，其中80%發生在發展中國家，HPV16和18是最常見的兩種致宮頸癌的病毒，70%的宮頸癌由這兩種病毒引起[1]。近年來采用陰道脫落細胞圖片檢查的普及，使不少宮頸癌患者能早期發現、早期治療，提高了患者的生存期。但臨床發現宮頸癌年輕化傾向明顯，25～54歲人群發病率不降反升[2]。導致早期宮頸癌復發的因素較多，許多國內外學者對早期宮頸癌的各方面進行了大量的研究分析，得出了很多與早期宮頸癌復發有關的原因。本資料通過對國內外最近五年相關文獻資料的研究學習，總結導致早期宮頸癌復發的分子生物學因素。

1 宮頸上皮細胞間質轉化

大量的研究表明宮頸上皮細胞間質轉化（EMT）與宮頸癌的形成和轉移復發有密切關系。

1.1 上皮細胞間質轉化（EMT）

正常的上皮細胞靠專門的細胞間粘附力緊密連接在一起，而且具有頂-基底極性。間質細胞形似紡錘體，連接松散，流動性強，具有前-后極性。上皮細胞通過復雜的程序轉變成間質細胞的過程稱為上皮細胞間質轉化。上皮細胞轉變為間質細胞后會失去原來的特性，中間會形成一種亞穩定的細胞既有上皮細胞又有間質細胞的特性，這是一種很多腫瘤都有的過程[3]。上皮細胞間質轉化有3種類型，其中第3型存在于腫瘤的侵襲與轉移中[4]。宮頸上皮細胞通過EMT過程，形成上皮樣的癌細胞失去極性，不穩定，但是還具有上皮細胞的其他特性，經惡化和分化形成具有轉移、侵襲能力的癌細胞。癌細胞離開原始位置，侵入基底膜下，侵入血管和淋巴管隨血液轉移到另一個地方形成轉移灶。在這過程中，還有以下因素參與，干細胞機制[5]、抗吞噬作用[6]、免疫逃避、藥物抗性等。

1.2 EMT的分子生物學

上皮細胞間質轉化的標志性分子變化主要有：（1）E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的下調。E-鈣粘蛋白和β-連環蛋白的下調與早期宮頸癌的組織學分化、轉移和復發成正相關[7]。（2）N-鈣粘著糖蛋白、纖維連接蛋白以及波形蛋白的上調表達。波形蛋白的上調表達與早期宮頸癌的轉移、復發成正相關[7]。（3）Rho GTP酶介導的細胞骨架重排。RhoC在正常宮頸組織、CIN 組織和宮頸癌組織中的表達逐漸增高，在有淋巴結轉移的宮頸癌組織中的表達明顯高于無淋巴結轉移組織，同時RhoC的沉默可以明顯降低SiHa細胞的體外粘附能力和侵襲、遷移能力[8]。（4）調控EMT的基因轉錄因子的上調和易位，如Twist1、Twist2、Snail、Slug、Six1等。Twist1、Twist2和E47抑制E-鈣粘蛋白的表達以及調節其它基因功能誘導EMT過程[9]。

1.3 EMT的信號通路

上皮間質轉化的信號通路有轉化生長因子（TGF-β）通路、Wnt通路、Notch通路、NF-κβ通路等。這些通路相互作用，共同調節EMT的過程[10]。

1.3.1 TGF-β信號通路 TGF-β是一組具有廣泛生物活性的多肽，哺乳動物中有三種亞型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是TGF-β相關的致瘤作用研究的重點，TGF-β1在腫瘤細胞中是上調的[11]。TGF-β通過細胞膜表面具有絲氨酸/蘇氨酸激酶活性的TβR Ⅰ和TβR Ⅱ結合形成復合物。TβR Ⅰ有ALK1/TSR-1、ALK1/TSK7L、ALK5/TβRⅠ 3種受體，TβR Ⅱ只有一種受體。TGF-β與TβR Ⅱ結合形成復合物使TβR Ⅰ磷酸化，隨之smads被磷酸化，誘導該復合物進入細胞核；這一信號通路受到干擾發生異常，與腫瘤的發生有重要關系[12]。與TGF-β信號通路影響細胞核內轉錄的因子有smad、Ras、Rho、TAK1、PP2A、β-catenin 以及NF-κβ、ATF2等。Smad7和TGF-β1與宮頸癌的發生發展、臨床分期、侵潤和淋巴結轉移相關[13]。Stephanie等[14]的研究發現TGF-β信號通路在EMT過程中起著重要作用，從而導致癌細胞具有侵襲和轉移能力。Iancu等[15]研究TGF-β通路在HPV誘導的宮頸癌中發現TGF-β通路的破壞與宮頸惡性進展有很大關系；在宮頸上皮樣瘤變到宮頸癌的過程中TGF-β1表達減少；同時TGF-β1受體基因表達也下降。

1.3.2 Wnt信號通路 Wnt信號通路有經典的Wnt信號通路、Wnt/ca+通路、Wnt/PCP通路，其中經典通路最重要，通過β-catenin激活基因轉錄；其機理概括為WntFzdDshβ-catenin降解復合體解聚β-catenin入核TCF/LEF基因轉錄[16]。參與Wnt信號通路的蛋白有Frizzled、Dishevelled、Gsk3β、CK1、APC、β-catenin等。Wnt信號通路受到刺激后，APC基因突變使β-catenin降解復合物合成障礙，以及β-catenin基因突變使β-catenin不能被磷酸化和泛素化降解，從而使β-catenin降解障礙，胞漿內游離的β-catenin聚集，進入核內激活Cyclin D1、C-myc等基因轉錄，導致腫瘤發生。細胞核的Survivin、Cyclin D1受Wnt通路的激活[17]，影響宮頸癌的復發和轉移。Survivin、P21、Cyclin D1蛋白對早期宮頸癌復發的影響中發現，三者在早期宮頸癌中的表達明顯升高，并且三者共表達時與臨床分期、病理分級有關；Survivin、Cyclin D1表達與早期宮頸癌復發有關，二者共同表達與盆腔淋巴結轉移有關[18]。

1.3.3 Notch信號通路 Notch信號通路是腫瘤血管生成和轉移的一個關鍵因素[19]。Notch信號通路由Notch、Notch配體（Jagged）、受體等組成，其中配體有Delta-like1、3、4，Jagged1、2，CSL，受體有Notch1、2、3、4，Notch信號通路在不同的腫瘤以及不同的階段作用不同。Notch信號通路概括為DeltaNotch酶切ICN細胞核CLS/ICN復合體基因轉錄[19]。Notch1中有Notch1-RBP-Jκ路徑、Notch1-PI3K-PKB-Akt路徑、Notch1-IKK-NF-κB路徑共同相互影響宮頸癌的發生發展[20]。Bajaj等[21]研究發現CD66+細胞中Notch信號通路對宮頸癌有重要作用。免疫組織化學分析顯示Notch3在宮頸鱗癌中過度表達，Notch陽性表達的宮頸癌患者比陰性表達的患者的生存率小[22]。

1.3.4 NF-κB信號通路 基本的NF-κB信號通路包括受體、受體近端信號銜接蛋白、IκB 激酶復合物、IκB 蛋白和NF-κB二聚體。受到刺激后IκB 激酶復合物被激活，IκB 蛋白磷酸化和泛素化，IκB 蛋白被降解，NF-κB二聚體釋放修飾后進入細胞核內，進行基因轉錄。NF-κB一般情況下位于細胞胞漿內，由兩個功能亞單位P65和P50組成，與其抑制因子IκB-α和IκKB-β結合在一起。宮頸癌中IκB-α的去磷酸化使IκB-α減少，從而NF-κB的P65進入細胞核內[23]，參與細胞核內基因的表達調控。NF-κB激活對腫瘤的促進作用主要有：（1）①NF-κB激活對宮頸癌的轉移有明顯促進作用[24]；（2）NF-κB的GADD45α和γ表達下調使腫瘤細胞逃避凋亡；（3）NF-κB上調Cyclin D1等，促進腫瘤細胞生長。NF-κB的P65和c-IAP2的過度表達和caspase-3的下調，是宮頸癌發生發展的重要因素[24]。

2 小結

目前國內外對早期宮頸癌治療后復發的因素研究較多，都認為復發是由于多方面、多路徑的因素共同作用的結果。發現復發轉移的關鍵因素，提高患者的生存率，減輕患者的痛苦是有必要的。除EMT、VEGF信號通路、notch信號通路等，是否可以發現更多關鍵的分子生物學層面的相關因素，使早期宮頸癌能更早的發現，得到早期治療，阻斷關鍵的分子生物路徑，減少復發率。

[參考文獻]

[1] Castellsagué X. Natural history and epidemiology of HPV infection and cervical cancer[J]. Gynecol Oncol，2008，110（3 Suppl 2）：S4-7.

[2] 湯釗猷.現代腫瘤學[M].第3版.上海：復旦大學出版社，2011：1124-1169.

[3] Lee JM，Dedhar S，Kalluri R， et al.The epithelial- mesenchymal transition：new insights in signaling， development， and disease[J]. Cell Biol，2006，172：973-981.

[4] kalluri R，Weinberg RA.The basics of epithelial-mesenchymal transition[J].J clin invest，2009，119（6）：1420-1428.

[5] Mani SA， Guo W， Liao MJ，et al.The epithelial-mesenchymal transition generates cells with properties of stem cells[J]. Cell，2008，133：704-715.

[6] Franco DL， Mainez J， Vega S，et al. Snail1 suppresses TGF-β induced apoptosis and is sufficient to trigger EMT in hepatocytes[J]. J Cell Sci，2010，123：3467-3477.

[7] Cheng Y， Zhou Y， Jiang W，et al.Significance of E-cadherin， β-catenin， and vimentin expression as postoperative prognosis indicators in cervical squamous cell carcinoma[J].Hum Pathol，2012，43（8）：1213-1220.

[8] 賀曉琪. RhoCGTP酶對宮頸癌侵襲轉移的影響以及與上皮間質轉化的相互調控機制[D].武漢：華中科技大學，2008：34-39.

[9] Peinado H，Olmeda D，Cano A.Snail，Zeb and bHLH factors in tumour progression： an alliance against the epithelial phenotype？[J].Nat Rev Cancer，2007，7：415-428.

[10] Yang J，Weiberg RA.Epithelial-mesenchymal transition at the crossroads of development and tumor metastasis[J].Dev Cell，2008，14（6）：818-829.

[11] Rik Derynck，Rosemary J.Akhurst，Allan Balmain. TGF-βsignaling in tumor suppression and cancer progression[J].Nature Genetics，2001，9（29）：117-129.

[12] 劉成敏，張成仁，王秀梅.Smads介導的TGF-β信號轉導通路與腫瘤關系的研究進展[J].中華腫瘤防治雜志，2010，17（8）：631-634.

[13] 孟茜，孟娟.Smad7和TGF-β1在宮頸癌中的表達及意義[J].當代醫學，2010，16（21）：78-79.

[14] Stephanie B.Walsh，Jianmin Xu，Hui Xu，et al.Cyclosporine A mediates Pathogenesis of Aggressive Cutaneous Squamous Cell Carcinoma by Augmenting Epithelial-Mesenchymal Transition：Role of TGF-β Signaling Pathway[J]. Mol Carcinog，2011， 50（7）： 516527.

[15] Iancu IV， Botezatu A， Goia-Ru?anu CD，et al.TGF-beta signalling pathway factors in HPV induced cervical lesions[J].Roum Arch Microbiol Immunol，2010，69（3）： 113-118.

[16] Paul Polakis.Wnt signaling and cancer[J].Genes Dev，2000，14：1837-1851.

[17] Clevers H.Wnt/beta-catenin signaling in development and disease[J].Cell，2006，127（3）：469-480.

[18] 李全紅，姚嘉斐，胡淑敏. Survivin、P21WAF1/CIP1及Cyclin D1蛋白表達及與早期宮頸癌復發的關系[J]. 中國癌癥雜志，2003，13（6）：495-499.

[19] Alejandro Garcia，Jessica J.Kandel.Notch：A key regulater of tumor angiogenesis and metastasis[J].Histol Histopathol，2012，27（2）：151-156.

[20] 周建松，葉楓.宮頸癌NOTCH1相關信號路徑研究進展[J].國際婦產科學雜志，2009，36（3）：238-240.

[21] Bajaj J， Maliekal TT， Vivien E，et al.Notch signaling in CD66+cells drives the progression of human cervical cancers[J]. Cancer Res，2011，71（14）：4888-4897.

[22] Yeasmin S，Nakayama K，Rahman MT，et al.Expression of nuclear Notch3 in cervical squamous cell carcinomas and its association with adverse clinical outcomes[J]. Gynecol Oncol，2010，117（3）：409-416.

[23] Kuncharin Y， Sangphech N， Kueanjinda P，et al.MAML1 regulates cell viability via the NF-κB pathway in cervical cancer cell lines[J]. Exp Cell Res，2011，317（13）：1830-1840.

分子生物學進展范文3

【關鍵詞】 中藥； 多藥耐藥； 分子生物學

目前，化療是治療惡性腫瘤的主要手段之一，而在化療過程中易產生腫瘤的多藥耐藥，大大降低了其療效。因此，如何解決多藥耐藥就成為了提高化療療效，改善患者生活質量的關鍵問題。多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)是一個多基因參與的過程，涉及多種耐藥相關蛋白［1］。不同腫瘤具有不同的耐藥表型，可以是某種耐藥基因表達，也可能是多種耐藥基因同時表達的結果，而由于中藥的多靶點作用，其可通過作用于多個耐藥相關蛋白達到逆轉多藥耐藥的作用。目前，中藥抗多藥耐藥的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年來中藥在逆轉多藥耐藥的分子水平的研究進展。

1 腫瘤多藥耐藥經典途徑

P-gp蛋白介導的多藥耐藥是研究最多，機制最為明確的多藥耐藥產生途徑，因此被稱為多藥耐藥的經典途徑。由MDR1基因編碼的P-gp蛋白ATP依賴性的藥物泵，其是通過水解ATP提供的能量，將進入細胞內的藥物泵出細胞，使得細胞內藥物濃度不斷下降，最終使藥物細胞毒作用減弱甚至喪失出現耐藥［2］。中藥下調P-gp蛋白的實驗研究較多，下面就分體外與體內實驗分別闡述。

1.1 體外實驗研究解霞等［3］對川芎嗪(TMP)逆轉多藥耐藥機制的研究顯示MCF-7/ADM 細胞P-gp蛋白表達率為(90.60±0.41)％，而加入非細胞毒性劑量川芎嗪后，耐藥細胞P-gp的表達率則降為(69.10±1.65)％（P

1.2 體內實驗研究李貴海等［6］粉防己堿對獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細胞相關蛋白的調控研究顯示單純應用DDP的模型組，其P-gp蛋白的表達為13.13±5.33，而粉防己堿無毒性高低劑量組其表達分別降為7.41±3.35和9.22±2.36，且其抑制率顯著提高，揭示逆轉耐藥的機制可能與其降低P-gp蛋白的表達有關。

另據實驗報道，中藥三氧化二砷、ECCG、甲基蓮心堿、補骨脂素等也可下調P-gp蛋白的表達而達到逆轉多藥耐藥的作用［7～10］。

2 多藥耐藥的非經典途徑

由MDR1基因編碼的P-gp蛋白過度表達介導的藥物外排是產生MDR的經典機制，除此外，MDR還與多藥耐藥相關蛋白(MRP)、肺耐藥相關蛋白（LRP）、谷胱甘肽S轉移酶、拓撲異構酶、細胞凋亡等多種非經典機制密切相關。

2.1 MRP介導的多藥耐藥多藥耐藥蛋白1(MRP1)屬于ATP結合的盒式(ATP-binding cassette，ABC)運輸蛋白家族成員，它可以通過細胞膜轉運多種抗腫瘤藥，從而限制抗腫瘤藥進入細胞［11］。

徐萌等［12］用漢防己甲素逆轉肺癌耐藥實驗研究發現經漢防己甲素處理12，24，36 h后MRP蛋白表達量的表達分別為32.21±4.79，30.56±4.58，25.55±7.58，而對照組則分別為53.42±7.42，52.98±10.35，60.98±9.37，差異有非常顯著性意義(P

另外，王利等［14］葛根素逆轉人胃癌裸鼠原位移植瘤多藥耐藥性的體內實驗研究顯示5-FU聯合葛根素組MRP蛋白陽性表達率為37.5%，顯著低于對照組生理鹽水組（82.5%）及單純5-FU組（74%）（P

2.2 谷胱甘肽介導的多藥耐藥多藥耐藥的產生機制復雜多樣，其中谷胱甘肽S-轉移酶活性的增強是產生多藥耐藥的重要機制。肖希斌等［15］的研究顯示K562/A02細胞GST-π的PCR擴增帶亮度較強，而經甲基蓮心堿(Nef)處理組PCR擴增帶亮度明顯減弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST-π基因的mRNA轉錄，蛋白質印跡檢測結果亦顯示，未經藥物處理的K562/A02組的蛋白雜交帶，明顯強于K562/A02+Nef組，表明Nef能抑制GST-π蛋白的表達。

苗立云等［16］青蒿琥酯逆轉K562/A02細胞耐藥性機理的研究顯示K562/A02細胞內GSH呈現高表達(P

2.3 核轉錄因子介導的多藥耐藥核轉錄因子（NF-κB）在細胞增殖和凋亡中起關鍵調控作用，而目前有研究顯示其在多藥耐藥的產生中也扮演著重要的角色，陳進偉等［17］K562/A02耐藥細胞NF-κB活性測定的研究發現活化后K562/A02細胞NF-κB表達明顯增強(P

2.4 LRP及拓撲異構酶介導的多藥耐藥肺耐藥相關蛋白（LRP）與拓撲異構酶亦是近期研究較多的耐藥介導介質。LRP作用機制是通過降低藥物的核質分布比率和通過囊泡、胞吐作用將藥物排出細胞［19］。拓撲異構酶(TopoⅡ)是調控DNA拓撲狀態的酶類，據研究發現，TopoⅡ質和量的改變會直接影響與DNA的結合，導致藥物誘導產生的裂解復合物形成減少，從而導致耐藥。孫付軍等［20］研究發現苦參堿可以逆轉小鼠S180腫瘤細胞獲得性多藥耐藥，其研究表明經其誘導后LRP、TOPOⅡ小鼠瘤體中可呈穩定高表達，而給予小鼠100mg/kg苦參堿后的瘤體中兩種蛋白的表達率分別降低為（10.76±6.28）%和（8.58±4.1）%，與對照組相比呈現顯著性（P

2.5 降低細胞內CA2+濃度Ca2+是細胞內一個重要的調節細胞生長、分泌和傳導等機制的信使，自從Tsuruo等初次發現MDR表型的腫瘤細胞內游離Ca2+濃度增高以來，許多實驗證明耐藥腫瘤細胞中Ca2+濃度高于非耐藥腫瘤細胞，又有學者證實鈣拮抗劑可逆轉細胞對藥物的耐藥性。蔡宇等［23］補骨脂素對HL60/HT耐藥細胞逆轉及對細胞內Ca2+濃度影響研究發現耐藥株HL60/HT細胞內Ca2+濃度明顯高于敏感株HL60(P

2.6 凋亡相關基因介導的多藥耐藥Bcl-2家族是細胞凋亡的關鍵調控物，其中Bcl-2相對分子量為26 000，蛋白水平與腫瘤細胞的MDR相一致，其過表達的腫瘤細胞凋亡受抑制，同時對阿霉素、長春新堿、順鉑等多種化療藥物耐藥，其機制可能在于其產物可以穩定細胞生存，抑制多種因素，包括化療藥物誘導的細胞凋亡，從而使細胞產生耐藥［25，26］。

艾小紅等［27］甲基蓮心堿逆轉肝癌HepG2/thermotolerance細胞對阿霉素耐受性的作用發現HepG2/thermotolerance細胞較HepG2細胞高表達Bcl-2蛋白，而甲基蓮心堿能夠下調HepG2/thermotolerance細胞的Bcl-2表達。鐘陸行等［28］參芪扶正注射液對K562/ADM多藥耐藥的影響研究顯示K562/ADM 細胞Bcl-2基因呈現高表達，經10 μl/ml參芪處理后其表達為68.39±3.89，而正常對照組則高達(93.82±2.32)，由此可見參芪扶正注射液可以明顯下調Bcl-2表達率。

3 多靶點作用逆轉機制

整體觀念是中醫的基本特點之一。從現代研究的角度看，可以體現在中藥治療腫瘤的多靶點作用。在逆轉多藥耐藥中，中藥的作用機制也并非只局限于某一點，而是一個綜合的作用，這也正是中藥在逆轉多藥耐藥研究中越來越受到人們重視的原因之一。

3.1 體外實驗研究侯華新等［29］用板藍根高級不飽和脂肪酸對耐藥肝癌細胞株BEL-7404/ADM逆轉作用實驗發現P-gp、MRP蛋白在Bel-7404/ADM 細胞中呈現高表達（與Bel-7404相比，P

3.2 體內實驗研究董琳等［32］甲基蓮心堿對胃癌多藥耐藥的逆轉作用研究發現P-gp、MRP在 SGC7901/VCR細胞中呈現高表達（P

4 結論與展望

目前，研究發現多藥耐藥的產生主要存在以下幾個方面的機制：①P-gp蛋白介導的耐藥，另多藥耐藥相關蛋白(MRP)及肺耐藥相關蛋白(LRP)的異常表達也受到重視；②酶系統異常，包括GSH，GST，DNA拓撲異構酶(TOPOⅡ)和PKC活性改變；③bc1-2基因高表達是抑制腫瘤細胞凋亡、導致腫瘤耐藥的重要因素。而綜合國內文獻發現，中藥對多藥耐藥的逆轉作用亦是多渠道、多途徑的，往往也是通過對不同耐藥途徑的綜合調控作用而實現的。

不過，我們通過對近幾年的文獻研究可以發現中藥在逆轉多藥耐藥研究中亦存在一定的問題，其主要體現在以下幾個方面：①研究多偏重于單體，而對復方研究較少，難以體現中醫辨證施治的特點；②對機制的研究多偏重于經典途徑，而對非經典途徑研究相對較少；③中藥對多藥耐藥的逆轉作用往往是多方面的，而有些文獻報道多只對單個耐藥相關蛋白表達進行研究，不免存在以偏概全之嫌；④亟需探索中藥研究的新方法，從而來彌補中藥成分復雜給實驗帶來不穩定性。

總之，通過對近5年的相關文獻分析，我們發現中藥在逆轉多藥耐藥的研究中已深入到分子生物學水平。其逆轉作用往往是通過對不同的耐藥蛋白的綜合作用而實現的。由于中藥成分的不單一性，使其作用往往不局限于某單一靶點，而是體現于多個靶點。其是通過多靶點的綜合作用，從而可以從多角度、多層次來發揮逆轉多藥耐藥的作用，另外中藥體現出了毒副作用小，作用顯著的優點而愈加受到國內外學者的關注。中藥逆轉劑的進一步研究推廣勢必有益于化療療效的提高和晚期癌癥患者的生活質量的改善。

【參考文獻】

［1］ Borowski E，Bontemps-Gracz MM，Piwkowska A．Strategies for overcoming ABC-transporters-mediated multidrug resistance(MDR) of tumor cells［J］．Acta Biochim Pol，2005，52f3):609．

［2］ Ambudkar SV，Dey S，Hrycyna CA，Ramachandra M，Pastan I，Gottesman MM.Biochemical，cellular，and pharmacological aspects of the multidrug transporter［J］.Annu Rev Pharmacol Tbxicol，1999，39:361.

［3］ 解 霞，郝立宏，高清波，等.川芎嗪逆轉腫瘤多藥耐藥性及其機制的研究［J］.中華腫瘤防治雜志，2009，12(18):1368.

［4］ 謝長生，周維順，馮正權，等.復方三根制劑對MDR細胞株K562/ADR和K562/VCR逆轉作用的研究［J］.中國實驗方劑學雜志，2003，9(4):26.

［5］ 許文林，江云偉，王法春，等.漢防己甲素逆轉K562/ADM細胞株多藥耐藥性機制研究［J］.實用癌癥雜志，2003，18(4):347.

［6］ 李貴海，劉明霞，孫付軍，等.粉防己堿對獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細胞P170，LRP，TOPOⅡ表達的調控［J］.中國中藥雜志，2005，30(16):1280.

［7］ 趙園園，金 鋒，梁 軍，等.三氧化二砷對人胃癌耐藥細胞系SGC7901/ADM耐藥逆轉及凋亡誘導作用的探討［J］.中國腫瘤臨床，2005，32(11):611.

［8］ 林曉貞，梁 鋼，黎 莉，等.ECCG對兩株耐藥腫瘤細胞的細胞毒增敏作用及抑瘤作用研究［J］.中藥藥理與臨床，2006，22(1):30.

［9］ 黃程輝，曹培國.甲基蓮心堿對乳腺癌MCF-7/Adr細胞MDR逆轉的研究［J］.腫瘤防治研究，2007，34(5):351-354.

［10］ 蔡 宇，蔡天革.補骨脂素逆轉多藥耐藥細胞系K562/ADR耐藥性研究［J］.中國藥理學通報，2003，19(10):1164.

［11］ DeGorter MK，Conseil G，Deeley RG，et al.Molecular modeling of the human multidrug resistance protein 1 (MRP1/ABCC1).Biochem Biophys Res Commun，2007，365(1):29.

［12］ 徐 萌，周 蓓.漢防己甲素逆轉肺癌化療耐藥和凋亡的實驗研究［J］.新中醫，2006，38(6):90.

［13］ 成 靜，馮覺平，王亞平，等.三氧化二砷對人肺腺癌A549/R細胞多藥耐藥相關蛋白表達的影響［J］.醫藥導報，2007，26(5):457.

［14］ 王 利，魏品康，秦志豐，等. 葛根素注射液逆轉人胃癌裸鼠原位移植瘤多藥耐藥性的實驗研究［J］.成都中醫藥大學學報，2005，28(1):42.

［15］ 肖希斌，謝兆霞，秦 群.甲基蓮心堿抑制K562/A02細胞GST-π的表達［J］.西安交通大學學報，2005，26(5):428.

［16］ 苗立云，張祖貽. 青蒿琥酯逆轉K562/A02細胞對阿霉素耐藥性機理的研究［J］.東南大學學報，2006，25(6):445.

［17］ 陳進偉，駱 蓉，張廣森，等. K562/A02耐藥細胞NF-κB活性測定及葛根素部分逆轉耐藥效應的初步研究［J］.中華血液學雜志，2006，27(7):482.

［18］ 宋玉成，夏 薇，江金花，等.鹽酸千金藤素逆轉EAC/ADR細胞多藥耐藥性的作用及其機制［J］.藥學學報，2005，40(3):204.

［19］ Kawabata S，Oka M，Shiozawa K，et al.Breast cancer resistance protein directly confers SN-38 resistance of lung cancer cells. Biochem Biophys Res Commun，2001，280：1216.

［20］ 孫付軍，王 寧，李貴海，等.苦參堿對獲得性多藥耐藥小鼠S180腫瘤細胞表達產物P170、LRP及TOPOⅡ表達的影響［J］.中藥材， 2004，27(11):838.

［21］ 季旭明，歐陽兵，王春燕，等.溫下方逆轉A549/DDP細胞的多藥耐藥及對膜表面蛋白表達的影響［J］.中國藥物與臨床，2006，6(12):885.

［22］ 蓋曉東，曾常茜，洪 敏.柴胡逆轉肝細胞癌多藥耐藥作用與相關機制的研究［J］.高等學校化學學報，2005，26(8):1446.

［23］ 蔡 宇，余紹蕾，徐 炎，等.補骨脂素對HL60/HT耐藥細胞逆轉及對細胞內Ca2+濃度影響研究［J］.中國藥學雜志，2006，41(12):905.

［24］ 王金華，葉祖光，孫愛續，等.粉防己堿逆轉人乳腺癌MCF-7多藥耐藥細胞的抗凋亡作用［J］.中國中藥雜志，2002，27(1):46.

［25］ Gadducci A，Cosio S，Muraca S，et al.Molecular mechanisms of apoptosis and Chemosensitivity to platinum and paclitaxel in ovarian cancer: biological data and clinical implications［J］. Eur J Gynaecol Oncol，2002，23(5):390.

［26］ Gadducci A，Cosio Pommier Y，Sordet O，et a1.Apoptosis defects and chemotherapy resistance:molecular interac tion maps and networks［J］. Oncogene，2004，23(16):2934.

［27］ 艾小紅，唐小卿，劉艷萍，等.甲基蓮心堿逆轉肝癌HepG2/thermotolerance細胞對阿霉素耐受性的作用［J］.癌癥，2007，26(4):357.

［28］ 鐘陸行，熊建萍，張錫泉，等.參芪扶正注射液對K562/ADM 多藥耐藥的影響［J］.江西醫學院學報，2006，46(4):41.

［29］ 侯華新，黎丹戎，韋長元，等.板藍根高級不飽和脂肪酸對耐藥肝癌細胞株BEL-7404/ADM逆轉作用實驗［J］.中國現代應用藥學雜志，2002，19(5):351.

［30］ 王 利，魏品康，秦志豐，等.欖香烯對耐藥胃癌細胞的逆轉實驗研究［J］.成都中醫藥大學學報，2005，28(2):51.

［31］ 蓋曉東，曾常茜，洪 敏.柴胡逆轉肝細胞癌多藥耐藥作用與相關機制的研究［J］.高等學校化學學報，2005，26(8):1446.

［32］ 董 琳，唐小卿，曹建國，等.甲基蓮心堿對耐長春新堿人胃癌細胞多藥耐藥性的逆轉［J］.中國病理生理雜志，2004，20(8):1407.

分子生物學進展范文4

關鍵詞：α-L-鼠李糖苷酶；基因克隆；基因表達；晶體結構

中圖分類號：Q71；Q786 文獻標識碼：A 文章編號：1007-7847（2015）01-0068-07

ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyofα-L-rhamnosidasefromMicrobialSources

ZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.2’3，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3

（1.CollegeofBioengineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，Fujian，China；2.ResearchCenterofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，Fujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，Fujian，China）

Abstract：a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40）cleavesterminalα-L-r

hamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydrolyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities，α-L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate―activeenzymes（CAZy）databaseintofourglycosidehydrolase（GH）families（GH13，GH28，GH78andGH106family），andthreeα-L-rhamnosidasesofGH78haveatypical（α/α）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsofα-L-r

hamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresummarized.

Keywords：α-L-rhamnosidase；genecloning；geneexpression；crystalstructure

（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）

α-L-鼠李糖昔酶（α-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））屬于轉化糖苷水解酶類，能夠專一、高效地水解許多糖苷類物質如柚皮苷（naringin）、蘆丁（rutin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的α-L-鼠李糖基[1]。α-L-鼠李糖苷酶的來源廣泛，在動物組織、植物和微生物中均發現了α-L-鼠李糖稈酶。目前關于動物組織[2]和植物來源的α-L-鼠李糖苷酶的報道相對較少，主要是通過細菌（如芽孢桿菌屬、擬桿菌屬、乳桿菌屬及單胞菌屬等）和真菌（如曲霉屬、青霉屬、木霉屬、犁頭霉屬及裂殖菌屬等）發酵來獲取α-L-鼠李糖苷酶。

不同微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶酶學性質存在差異。細菌來源的α-L-鼠李糖苷酶最適pH呈中性或堿性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最適pH一般在酸性范圍內，主要在4.0～7.0[3-5]之間。微生物中的α-L-鼠李糖稈酶的最適反應溫度一般是45?60℃[4、6]。近年來也有發現耐熱、嗜低溫及耐堿性的α-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉MBRC4308[6]分泌的α-L-鼠李糖苷酶，在60℃保溫1h后酶活仍有初始酶活的80%；ThermophilicbacteriumPRI-1686[7]產生的α-L-鼠李糖苷酶最適溫度為70℃，在60℃處理24h后酶活為處理前的20%；而亞南極環境中的單胞菌屬細菌[8]中的α-L-鼠李糖苷酶在-1-8℃具有活性。Rojas[9]等從白黃筍頂孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分離到一種新型堿性α-L-鼠李糖苷酶，以對硝基苯酚-α-I-鼠李糖苷（pNPR）為底物測得酶反應的最適pH值為8.0，它可以在堿性條件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物質，擴大了α-L-鼠李糖苷酶的應用范圍。

α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧類果汁苦味的有效物質[1]。果汁中的苦味物質柚皮苷被柚苻酶水解的過程共有兩步反應，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背生成普魯寧，接著在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脫苦過程中，α-L-鼠李糖苷酶參與的第一步反應是脫苦的關鍵，Chien[10]等用HPLC法證明僅有柚苷酶的另一組份β-D-葡萄糖背酶存在時，苦味物質抽皮苷是不能被水解的。有研究報道，對葫溪蜜柚果汁進行脫苦時，在α-L-鼠李糖苷酶加量為10U/mL的條件下40℃處理60min，苦味就能降低到閾值以下[11]。除了在飲料行業中用來去除柑橘類果汁的苦味[3、12]，在其他行業也具有很多潛在的應用價值，如通過水解柚皮苷生產L-鼠李糖[1]和普魯寧降低黃酮類化合物的生產成本；增加釀造酒的香味[14、15]，改善葡萄汁和飲料的香氣成分；切除一些糖苷類藥物原料末端的L-鼠李糖等[16]。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要應用價值，越來越多的國內外學者致力于該酶的研究開發。本文分別對微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表達以及該酶的晶體結構研究進展進行了闡述。

1α-L-鼠李糖苷酶的分子生物學研究

微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一種誘導酶，需要誘導物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在時才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的誘導受到碳源代謝調節，給微生物發酵產α-L-鼠李糖苷酶造成阻礙。同時隨著α-L-鼠李糖苷酶的應用越來越廣泛，傳統發酵的生產方式不能滿足日益增長的需求，也很難達到很高的純度。因此，選擇現代生物技術來研究α-L-鼠李糖苷酶是一種必然趨勢

1.1α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆

早期對a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是該酶的分離純化及酶學性質，2000年后對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日漸增多，表1列舉了2000年以來微生物中GH78家族和近兩年其他家族已克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因目前，從微生物中克隆α-L-鼠李糖苷酶基因主要采用PCR和構建文庫的方法。據PuriM等報道，采用構建文庫的方法克隆α-L-鼠李糖苷酶基因可以通過以下兩種方法篩選陽性克隆；一種是利用pNPR作為底物篩選含有α-L-鼠李糖苷酶活性的陽性克隆；另外一種是采用多克隆抗體篩選產鼠李糖苷酶的陽性克隆。

細菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究比真菌稍早，在2000年[18]就有學者報道對Clostridium.stercorarium菌株中鼠李糖苷酶基因ramA的克隆。有些細菌中存在多個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，且它們的序列存在差異，在Bacillussp.GLl[31]中克隆到rhaA和rlmB兩個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，它們分別編碼兩個不同的α-L-鼠李糖苷酶。來自植物乳酸桿菌（Latto-bacillusplantarum）[23]的rhaB1和rhaB2都是編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，它們的序列相似性僅為26%。不同細菌中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因序列各異，Bacillussp.GLl[31]中rhaA和rhaB與Clostridiumstercorarium中ramA序列相似性分別為41%和23%。植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantarum）[23]中的α-L-鼠李糖酶KhaB1和RhaB2與Bacillussp.GLl[31]中該蛋質（登錄號：BAB62315）的氨基酸序列相似性均為23%，與ThermomicrobiaPRI-1686[7]中的RhaB（登錄號：AAR96047）相似性分別為22%和23%。而少動鞘氛醇單胞菌FP2001（Sphingornonaspaucimobilis）[21]中克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有3354個核苷酸，同源性比對發現它與其他屬于糖基水解酶（GH）家族78的α-L-鼠李糖苷酶基因沒有顯著的同源性。

國外關于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在來源于曲霉屬的α-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉屬中的棘孢曲霉[19]、白曲霉[6]和構巢曲霉[29]等已有克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的研究報道。對目前已知的α-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析發現，不同來源的α-L-鼠李糖苷酶基因序列差異較大。從棘孢曲霉[19]中克隆的兩種編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因rhaA和rlmB的核苷酸序列幾乎沒有相似性，二者氨基酸序列相似性為60%，而它們與Clostridiumstercorarium中該酶的氨基酸序列[18]的一致性僅有11%。白曲霉中[6]α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列與棘孢曲霉[19]中rhaA和rhaB的氨基酸序列相似性分別為75%和67%，與細菌[7、18、20、21]來源的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于30%。有些真菌中存在著多個編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉[19]中分離到兩種α-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它們對應的基因：有研究者對構巢曲霉[29]的基因組信息進行分析發現，至少存在8個可能具有α-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到rhaA和rhaE兩種：我國學者對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究相對較晚，主要是對犁頭霉屬[32-34]的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出蘆丁-α-鼠李糖苷酶基因cDN段[32]和人參皂甙-α-鼠李糖苷酶基因[33、34]。近年有研究者從黑曲霉DLFCC-90菌株[26]中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，該序列和α-淀粉酶的序列有較高的同源性，被歸類到糖苷水解家族GH13。此外，筆者巳經從黑曲霉JMU-TS528（集美大學生物工程學院發酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，共編碼655個氨基酸，序列已上傳至NCBI數據庫（登錄號：KC750908.1），經同源性比對發現，它與白曲霉[6]（AB374267.1）中的α-L-鼠李糖苷酶基因的相似性高于90%。

雖然對微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的報道越來越多，但對該基因在轉錄水平上的調控研究并不多。目前，僅指出α-L-鼠李糖苷酶基因的表達量受誘導碳源的影響，葡萄糖在轉錄水平抑制該基因的表達。因此，筆者認為今后的研究可在克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的基礎上進一步鑒定與該基因跨膜轉移或翻譯直接相關的基因和蛋白，闡明葡萄糖抑制基因與α-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的關系，從而明確碳源代謝調控α-L-鼠李糖苷酶基因的機制。

1.2α-L-鼠李糖苷酶基因的表達

通過α-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生產普魯寧可以降低普魯寧的生產成本，但目前報道的α-L-鼠李糖苷酶大多數是以柚苷酶的形式存在，而在柚苷酶水解柚皮苷的過程中，普魯寧作為一種中間產物，會進一步被分解成柚皮素，不能大量積累普魯寧。所以表達出只具α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白質具有重要的應用價值。近幾年有人對α-L-鼠李糖苷酶基因的表達進行了研究，表2列出了具有代表性的微生物中α-L-鼠李糖苷酶基因表達出的具有活性的蛋白。

在研究α-L-鼠李糖苷酶基因表達時，大腸桿菌是研究者常用的表達宿主。雖然采用原核表達系統來表達真核微生物中的基因容易出現沒有活性的產物，目前已有不少研究者將微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶基因，通過大腸桿菌表達出有活性的蛋白。如Jules[22]等將植物乳酸桿菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸乳酸桿菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp、ram2Lp和ramALa，在E.coli中表達出活性蛋白Ram1Lp、Ram2Lphe RamALa，其中RamALa酶活最大，達到8.5mU/μg。不同的α-L-鼠李糖苷酶基因表達后產物的水解底物不同，乳酸片球菌[24]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因ram和ram2，采用E.coli表達系統成功表達出活性蛋白Ram和Ram2，但Ram只能有效地水解合成底物pNPR，而Ram2能特異性水解橙皮苷和蘆丁糖，兩種酶均不能水解柚皮苷，以pNPR為底物測得Ram和Ram2的酶活分別為8.7U/mg和0.036U/mg。植物乳酸桿菌NCC2451231中rhaB1和rhaB2基因表達的RhaBl和RhaB2能特異性地水解α-1，6糖苷鍵，但不能水解柚皮苷中的a-1，2糖苷鍵，RhaB1和RhaB2的最適底物是橙皮苷和蘆丁。有研究者發現有些細菌中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因表達后的產物是二聚體，例如Clostridium stercorarium[18]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因ramA成功在（PWS1261）細胞中表達出的蛋白Ram78A包含兩個相同的亞基，Lactobacillusplantatum[23]中rhaB1和rhaB2基因采用E.coli表達出的α-L-鼠李糖苷酶以二聚體形式存在。

由于原核表達系統本身存在的一些缺陷，有時表達出的α-L-鼠李糖稈酶不具有活性[36]，所以有研究者采用真核表達系統來表達α-L-鼠李糖苷酶基因。目前對α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達的報道并不多，我國研究者已在酵母中成功表達了蘆丁鼠李糖苷酶基因[36]、人參皂苷-α-鼠李糖苷酶基因[33]以及黑曲霉中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因[26]。其中黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因序列與α-淀粉酶基因序列相似性較高，通過酵母表達后的產物具有水解蘆丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母細胞表面展示技術將Alternaria sp.L1[28]中rhal1編碼的α-L-鼠李糖苷酶固定在釀酒酵母細胞表面，該細胞能特異性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷達到果汁脫苦的作用。RhaL1固定在釀酒酵母細胞表面后，該酶在70℃環境中活性很高，在60℃處理2h后酶活達到處理前的95%，擴大了該酶在工業生產中的應用范圍。目前對黑曲霉來源的α-L-鼠李糖苷酶基因的異源表達研究較少，筆者正在研究從黑曲霉jMU-TS528菌株中克隆到的α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表達。國外的研究者報道了土曲霉[25]、構巢曲霉[29]和棘孢曲霉[35]中編碼α-L-鼠李糖苷酶的基因在酵母中的成功表達。鼠李糖能夠誘導構巢曲霉[29]中rhaE的表達，葡萄糖對該基因的表達產生抑制作用，rhaE在釀酒酵母中表達的產物，能夠水解底物pNPR，酶活達到1.4U/mL。通過系統發育樹分析發現，在真菌來源的α-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE是首個與細菌中α-L-鼠李糖苷酶基因親緣關系比其他真菌中的α-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表達系統得到的產物和天然發酵的α-L-鼠李糖苷酶一樣，都可以水解蘆丁，重組酶酶活力高達9U/mL，比天然酶高出3倍，而且大大縮短了天然發酵獲取α-L-鼠李糖苷酶的時間，同時酶的產量比天然發酵的α-L-鼠李糖苷酶提高了4倍。盡管近年來，利用基因工程技術來構建產α-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐漸增多，并取得了一定的進展，但酶活水平始終未能達到工業化應用的要求；目前國際上對α-L-鼠李糖苷酶分泌機制的研究也不多，因此如何進一步提高該酶的胞外分泌水平，是該酶能否得到推廣應用的關鍵：

2α-L-鼠李糖苷酶的結構生物學

蛋內質需要形成一定的空間結構才能有活性，近年來，雖然對α-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表達的報道很多，佴對它的結構方面的研究報道還比較少：2000年Zverlov成功克隆Clostridiumstercorarium[18]中編碼α-L-鼠李糖苷酶基因ramA后，首次通過圓二色譜法測得該酶二級結構包含27%的α-螺旋和50%的β-折疊結構。

CAZy（http：///）數據庫依據氨基酸序列相似性對糖苷水解酶類進行了分類，微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。目前，由PDB數據庫可以搜到3個鼠李糖苷酶的晶體結構，分別是來自Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482菌中的α-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中α-L-鼠李糖苷酶。Cui[31]等于2007年解析了α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶體結構，該酶由N、D1、D2、C和A5個結構域組成；結構域A包含其（α/α）6的桶狀結構，Asp567、Glu572、Asp579和Glu841在該酶的催化作用和底物結合方面起到了關鍵作用，它們與鼠李糖相互作用，將其突變后，α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并認為RhaB的空間結構與Lactobacillusbrevis菌株的麥芽糖磷酸化酶MalP和Vibrioproteolyti-cus菌株的殼二糖磷酸化酶ChBP的結構相似。來自Streptmnyces avermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶體結構有兩種，一種是原蛋白形式，另外一種是包含L-鼠李糖的晶體結構，這兩種形式的結構變化很小，RMSD值僅為0.21A，它們均由1個α和5個β結構域組成，分別是N、D、E、F、A和C；結構域A包含（α/α）6的桶狀結構，與Cui[31]等報道的RhaB的催化域相似；SaRha78CM由13個α-螺旋組成，結構域N包含10個β-折疊，結構域D的11個β-折疊和E的13個β-折疊展現出一個β-卷心折疊，結構域F由16個β-折疊組成兩個平行的β-折疊片；L-鼠李糖分別結合在結構域A和D中，結構域A中的L-鼠李糖結合在該酶的活性口袋的芳香基氨基酸TrP747和TrP640之間，與周圍的氨基酸形成12個氫鍵，結合后的船型構象被認為是GH78家族α-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的過渡態構象；結構域D中的L-鼠李糖結合在β-折疊間，L-鼠李糖的O2、O3和O4原子分別和α-L-鼠李糖苷酶的Trp203、Asnl80和AsP179形成氫鍵，L-鼠李糖的O3、O4位置與一個正二價鈣離子形成配位共價鍵，同時鈣離子與該酶通過Aspl79、ASnl80、Asn228和Pro233氨基酸產生相互作用：Glu636和Glu895是在該α-L-鼠李糖苷酶的催化作用中的關鍵氨基酸，Glu636在催化過程中提供質子，將其突變后，該酶酶活下降了40倍。通過對α-L-鼠李糖苷酶的晶體結構的分析發現，該酶有4個結構域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化域是一個（α/α）6的桶狀結構，鼠李糖結合在該桶狀結構的深溝里[31]。此外，在streptomyces awermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶中還發現了一個新的非催化碳水化合物結合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67位于結構域D，通過鈣依賴的方式與L-鼠李糖結合，在用EDTA螯合鈣之后，SaCBM67失去與L-鼠李糖結合的功能。通過對179和180位置的氨基酸的突變實驗發現，突變后該酶水解阿拉伯樹膠的活性大大降低，而對水解芳香基鼠李糖苷的活性影響不大，研究者認為SaCBM67對該菌株中的α-L-鼠李糖苷酶酶活有著一定的影響。

3展望

微生物來源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潛在的應用價值，近年來，對該酶的研究越來越受到學者的關注，從不同水平對α-L-鼠李糖苷酶進行了研究。首先，在α-L-鼠李糖苷酶產酶菌株的篩選、發酵條件的優化以及酶的分離純化和性質研究日趨成熟，為產業生產α-L-鼠李糖苷酶酶制劑及α-L-鼠李糖苷酶在食品醫藥加工工業中的應用提供了一定的參考價值；其次，在分子生物學方面，對不同來源的α-L-鼠李糖苷酶基因進行了克隆，并通過生物信息學分析、基因的表達以及晶體結構的研究，使得對α-L-鼠李糖苷酶的了解進一步深入。這些研究為構建工程菌生產α-L-鼠李糖苷酶，提高α-L-鼠李糖苷酶的酶產量，降低目前生產α-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理論指導。但目前對不同來源的α-L-鼠李糖苷酶的合成途徑、誘導機制和催化機制研究較少，因此，可進一步通過利用分子生物學、結構生物學和計算生物化學等技術，對α-L-鼠李糖苷酶進行更深層次的研究。從分子水平上來研究α-L-鼠李糖苷酶的催化機理，結合定點突變等技術來提高α-L-鼠李糖苷酶的催化活性。同時，通過計算模擬等手段研究α-L-鼠李糖苷酶的底物結合特異性，擴大α-L-鼠李糖苷酶在各生產工藝中的應用范圍因為自然分離純化的酶難以滿足苛刻的工業生產過程，所以酶的改造成為一種非常有效的替代途徑，依照α-L-鼠李糖苷酶的晶體結構信息，加深對其結構和功能的認識，為α-L-鼠李糖苷酶定向進化和改造奠定理論基礎：

參考文獻（References）：

[1]YADAV V， YADAV P K， YADAV S， el al. α-L-rhamnosidase： a review[J]. Process Biochemistry， 2010，45（8）： 1226-1235.

[2|QIAN S， WANG H Y， ZHANG C Z， et al. Isolation and characterizalion of dioscin―α-L-rhamnosidase from bovine liver[J]. Journal of Molecular Catalysis B： Enzymatic， 2013， 97（1）： 31-35.

[3]YADAV S， YADAV R S S， YADAV K S S. An α-L-rliam- nosidase from Aspergillus awumori MTCC-2879 and ils role in debittering of orange juicefj]. International Journal of Food Science & Technology， 2013，48（5）： 927-933.

[4]王艷君.腸球菌中α-L-鼠李糖苷酶的分離純化及酶學性質 研究[D].濟南：山東輕工業學院（WANG Yan-jun. Research Progress of α-L-rhamnosidase[D]. Jinan： Shandong Institute of Light Industry）， 201 1.

[5]YADAV S， YADAV H S S， YADAV K D S. Purification and characterization of α-L-rhamnosidase from PeniciUium rorylopholum MTCC-2011[J]. Process Biochemistry， 2013，48（9）； 1348- 1354.

[6] TAKUYA K. YUICHIKO M， NAHOKO N， et al. Characteriza?tion of an α-L-rhamnosidase from Aspergillus kawachii and its gene[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 2008，80（6）： 1007-1013.

[7]BIRGISSON H. HREGGV1DSS0N G O， FRIDJONSSON O H.et al. Two new thermostable α-L-rhamnosidases from a novel thermophilic bacterium[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2004， 34（6）： 561-571.

[8] ORRILLO A G， LEDESMA P. DELGADO O D， el al. Cold- active α-L-rhamnosidases from psychrotolerant bacteria isolat eel from a sub-Antarctic ecosystem[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2007， 40（2）： 236-241.

[9] ROJAS N L， VOGET C E， HOURS H A， et al. Purification and characterization of a novel alkaline α-L-rhamnosidase produced by A crostalagmus luteo albus[J]. Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology， 2011， 38（9）： 1515-1522.

[10] CHIEN P O，SHEN F U， YUAN T. Monitoring enzymatic debittering in grapefruit juice by high performance liquid chromatography[J]. Journal of Food and Drug Analysis， 2001. 9（2）： 115-120.

[11]黃高凌，倪輝，胡陽，等.柚皮苷酶對g溪蜜柚果汁脫苦效果 工藝優化[J]食品科學（HUANG Gao-ling， NI Hui. HU Yang， et al. Optimization of naringinase treatment for debittering of Citrus grandis （L. ） Osbeck cv. guanximiyou juice [J]. Food Sci?ence）， 2010， 31（8）： 70-71.

[12] BUSTO M D. MEZA V， MATEOS N P. Immobilization of naringinase from Aspergillus niger CECT 2088 in poly （vinyl alcohol） cryogels for the debittering of juices[J]. Food Chemistry， 2007， 104（3）： 1177-1182.

[13] VILA-REAL H， ALFAIA A J. BRONZE M R，et d. Enzymatic synthesis of the flavone glucosides， prunin and isocjuerc-etin， and the aglycones， naringeriin and quercetin， with selective α- L-rhamnosidase and β-D-glucosidase activities of naringinase [J]. Enzyme Research， 2011， 2011： 692618

[14J CALDINI C， BONOMI K， PIFFERI P G， et al. Kinetic and immobilization studies on the fungal glycosidases for the aroma enhancement in wine[J]. Enzyme and Microbial Technology， 1994. 16（4）： 286-291.

[15] ALVARENGA A E， ROMERO C M. CASTKO G R . A novel α-L-rhamnosidase with potential applications in citrus juice* industry and in winemaking[J]. European Food Research and Technology， 2013， （1）： 1-9.

[16] MONTI D， PISVEJCOVA A， KREN V， et al. Generation of an α-L-rhamnosidase library and its application for the selective derhaninosylation ol natural products[J]. Biotechnology and Bioengineering， 2004， 87（6）： 763-771.

[17] PURI M. Updates on naringinase： structural and biotechnological aspects[J]. Applied Microbiology and Biotechnology， 201 1. 93（1）： 49-60.

[18] ZVERLOV V V，HERTEL C， BRONNENMEIER K， et d. The thermostable α-L-rhamnosidase RamA of Clostridium stercorarium： biochemical characterization and primary structure of a bacterial α-L-rhamnoside hydrolase， a new type of inverting glycoside hvdrolase[J]. Molecular Microbiology， 2000， 35（1）： 173- 179.

[19] MANZANARES P. BROECK H C， GRAAFF L H， et al. Pu?rification and characterization of two different α-L-rhamnosi- dase， RhaA and RhaB， from Aspergillus aculecitus[J]. Applied Environment Microbiology， 2001， 67（5）： 2230-2234.

[20] HASHIMOTO W，MIYAKE O， NANKAI H， et al. Molecular identification of an α-L-rhamnosidase from Bacillus sp. strain GL1 as an enzyme involved in complete metabplism of gella[J]. Archives of Biochemistry and Biophysics， 2003， 415（2）： 235-244.

[21] MIYATA T， KASHIGE N， SATHO T， et al. Cloning， sequence analysis， and expression of the gene encoding Sp hingornonas paucimobilis FP2001 α-L-rhamnosidase[J]. Current Microbiology， 2005. 51（2）： 105-109.

[22] JULES B， DANIELA M， SAMUELE V， et al. Characterization of rhamnosidases from Lactobacillus plantarum and Lactobacillus acidophilus[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2009， 75（11）： 3447-3454.

[23] Avila M. JAQUET M， MOINE D， et d. Physiological and biochemical characterization of the two alph α-L-rhamnosidases of Lactobacillus plantarum NCC245[J]. Microbiology， 2009， 155（Pt 8）： 2739-2749.

[24]MICHLMAYR H， BRANDES W， EDER R， et al. Characteri?zation of two distinct glycosyl hydrolase family 78 α-L-rhamnosidases from Pediococcus acidilactici[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2011， 77（18）： 6524-6530.

[25] GERSTORFEROVA D， FLIEDROVA B， HALADA P， et al. Recombinant α-L -rhamnosidase from Aspergillus terreus in selective trimming of rutin[J]. Process Biochemistry， 2012， 47（5）： 828-835.

[26] LIU T，YU H， ZHANG C， et al. Aspergillus niger DLFCC-90 rhamnoside hydrolase， a new type of flavonoid glycoside hydro lase[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2012， 78（13）： 4752-4754.

[27] NGHI DO H. BITTNER B， KELLNER H， et al. The wood rot ascomycete Xylaria polymorpha produces a novel GH78 glycoside hydrolase that exhibits alpha-L-rhamnosidase and feru- loyl esterase activities and releases hydroxycinnamic acids from lignocelluloses[J]. Applied and Environmental Microbiology，2012， 78（14）： 4893-4901.

[28] LIU Q， LU L， XIAO M. Cell surface engineering of alph α-L- rhamnosidase for naringin hydrolysisfj]. Bioresource Technology， 2012， 123（1）： 144-149.

[29] TAMAYO-RAMOS J A， FLIPPHI M， MANZANARES P， et al. L-rhamnose induction of Aspergillus nidulans α-L-rhamnosi-dase genes is glucose repressed via a CreAindependent mechanism acting at the level of inducer uptake[J]. Microbial Cell Factories， 2012， 11（1）： 1-17.

[30] ICHINOSE H， FUJIMOTO Z， KANEKO S， et al. Characteriza?tion of an α-L-rhamnosidase from Streptomyces avermitilis[J]. Bioscience Biotechnology and Biochemistry， 2013， 77（1）： 213- 216.

[31] CUI Z， MARUYAMA Y， MIKAMI B， et al. Crystal structure of glycoside hydrolase family 78 α-L-rhamnosidase from Bacillus sp. GL1[J]. Journal of Molecular Biology， 2007， 374（2）： 384-398.

[32] 馬安周，王栩林，魚紅閃，等.蘆丁-α-鼠李糖苷酶基因的克隆[J].大連輕工業學院學報（MA An-zhou， WANG Xu-lin， YU Hong -shan， et al. Cloning of rutin -α -rhamnosidase gene[J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry）， 2005， 24 （1）： 8- 11.

[33] 李娜，朱博，金鳳燮，等.人參皂甙-α-鼠李糖苷酶基因的亞克隆及表達[J].大連工業大學學報（LI Na， ZHU Bo， JIN Feng-xie， et al. Sub-cloning and expression of ginsenoside-α-rhamnosidase gene [J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry）， 2009， 28（5）： 326-329.

[34] 楊菲，湯敏謙，袁曉東，等.人參皂苷-α-鼠李糖苷酶基因的 cDNA 5'末端的快速擴增[J]大連輕工業學院學報（YANG Fei， TANG Min-qian， YUAN Dong-xiao， et al. Rapid ampli cation of 5'-end cDNA of ginsenoside -α-rhamnosidase [J]. Journal of Dalian Institute of Light Industry）， 2007，26 （4）： 306-309.

[35] MANZANARES P， OREJAS M， GIL J V，et al. Construction of a genetically modified wine yeast strain expressing the As?pergillus aculeatus rhaA gene， encoding an α-L-rhamnosidase of enological interest[J]. Applied and Environmental Microbiology， 2003， 69（12）： 7558-7562.

分子生物學進展范文5

關鍵詞： 高等師范院校 分子生物學 教學改革

分子生物學是高等師范院校在生物學、生命科學、基礎醫學等學科開設的核心課程之一。本學科理論研究深，前沿性強，不但是生物學研究與教學的基礎課，而且廣泛應用于生物實驗的各個領域。分子生物學主要研究蛋白質、核酸等生物大分子形態、結構及其相關性與變化規律的學科。分子生物學的理論體系演變發展步伐很快，也對高校的教學與科研帶來了巨大的挑戰。

高等師范院校的教學與一般高校不同，在科學研究與科學教育的同時還肩負著培養教師的任務。因此，各學科在教學過程中，不僅僅要把知識傳授給學生，還要讓學生掌握研究方法與教學技巧。高等師范院校在教學中更要重視學生知識的傳承轉向能力的培養。我國很多的高等師范院校都在推行教學改革，在分子生物學教學方面如何聯系科學發展的實際應用與理論教學是高等師范學院在分子生物學教學改革方面所要研究的課題。高師院分子生物學教學改革實踐要做好以下幾點。

1.選好教材，加強專業英語教學

教材是學生學習與教師備課的基本資料，分子生物學在市面上的教材有很多，由于分子生物學的知識涵蓋面廣，不同的教材編寫的側重點不同。其中趙亞華老師編寫的《分子生物學教程》，陳啟民等主編的《分子生物學》，朱玉賢等主編的《現代分子生物學技術》在大學比較常見，這些都比較適合本科教育。各種各樣的教材要求老師在選擇教材時要根據時展特點、師范學校辦學風格來綜合考慮。很多學校在未經開會探討的情況下，根據個別人的觀點來購買教材，這是不合理的。在選教材方面也不能一味求新，新同學沒有專業基礎，選擇既理論基礎深厚，又能反映分子生物學新進展的教材是有效教學的前提。

分子生物學是門基礎理論與科技前沿結合緊密的學科，在大學推行雙語教學的今天，選擇教材也應該搭配一本外文教材。開設一門分子生物的專業英語是必要的。如果師范院校學生的專業英語水平提高了，當走向社會，對提高我國的基礎教育水平也有很大的幫助。在外文教材的選擇上，各高校一般選擇Gkarp的Cell and Molecular Biology，Robert Weaver的Molecular Biology，P.C.Turner的Molecular Biology。教材的選擇也要根據學生的實際水平，選擇與中文教材近似的外文教材，不能脫離實際，否則不但起不到提高學生專業英語水平的目的，反而會嚴重挫傷學生的學習積極性。

2.教學大綱的革新

進入了二十一世紀，教學設施已經有了明顯的改善，很多學校仍然沒有擺脫舊的講學模式，經常是教師在講臺一味照課本或者講義講課，學生拼命地記筆記，有的老師甚至省去了板書。有的學校的多媒體教學設施甚至成了迎接教學評估的形式。這樣的現象在高等師范院校更嚴重。在課程內容安排上，不僅要做到重點突出專業性，而且要與其他課程結合穿插，與生物化學、微生物遺傳學、遺傳學、基因工程等課程相互滲透、相互聯系。在課堂上要把多媒體教學作為主要教學手段，可以制作課件，也可以留下幾章讓學生自學制作，課件可以在下課后拷貝給學生。這樣既可以提高學生的學習積極性，又可以避免學生上課只顧記錄筆記，而不注重聽課與理解的傳統教學弊病。老師在編寫課件時還要做好與教育學理論的結合，并配合視頻、圖片、新聞等形象的、有時代感的元素，與學生互動。比如原核生物和真核生物的染色體結構、原核生物的轉錄、DNA的復制、蛋白質的合成、基因克隆等，用形象的圖片與視頻效果要比看教材好得多。

3.加強教師的定期培訓

高等師范院校肩負著培養教師的責任，所以師范學校的教師既是老師又是學生。教師在教書育人的同時還要加強自身的學習，不但要學習專業知識，而且要加強教學方法與水平的學習。教學改革在現實層面首先改革的是教師，加強對教師的專業培訓，提高政治思想水平，強化對教師的科學管理，這些都是高等師范院校要重視的。分子生物學領域知識更新快，發展迅速，而且分子生物學最突出的科研成果一般都發表在外文期刊上。教師提高英語水平與計算機應用水平，加強隨時關注分子生物學領域發展動向的意識，并將本學科相關的新概念、新思路和新成果等內容引入課堂，給學生提供一些能夠接受的，難度適中的文獻，可以與學生一起開闊視野、一起提高。另外，教師人格與教學風格對學生影響也很大，不但能影響到學生對分子生物學的理解，而且能影響到學生以后的教學風格的成型，注意語言與修養的培養，也是高等師范院校在教學中要注重的。

4.改革教學模式，強化實驗教學

在繼承傳統的教學方式嚴謹的優點的同時，在課程上到一定階段，學生對分子生物學有所了解后，在教學方式上可采取課堂討論等互動教學方式，同時將新知識、新進展作為專題讓學生自己研究了解，并作出總結在課堂討論。互動式教學可以將分子生物學理論細分，讓學生分組作深入探討，以提問回答的形式由老師引導完成學習，徹底改變傳統教學模式枯燥的特點。

高等師范院校教學改革是提高教學質量的關鍵，也是培養優秀教師的前提，不僅體現在分子生物學課程中，而且涵蓋了教學的各個方面。不斷地改革意味著不斷地突破，這樣才能培養出符合時代要求的教師。

參考文獻：

［1］諸葛強.改進《分子生物學》教學效果的探討［J］.中國農業教育，2004.3：37-38.

分子生物學進展范文6

關鍵詞生物技術;分子生物學;教學改革

分子生物學是從分子水平上研究生命現象、生命本質及其規律的的科學，主要研究核酸、蛋白質等生物大分子的形態、結構特征及其重要性、規律性和相互關系的科學，是21世紀最具活力的生命科學之一。[1]目前，分子生物學是生物技術專業學生一門重要的專業必修課。因此，確定合理、科學的教學改革方案，優化、重組教學內容，精心設計教學方法和教學手段，對保證生物技術專業分子生物學課程教學質量具有重要意義。[2]

1分子生物學教學現狀

（1）分子生物學是生物技術專業的一門主要課程，教學單位往往會根據教師上課需求以及市場需求來選擇教材，然而，卻有可能忽略了對學生的接受能力以及理解程度的考慮。部分分子生物學教材內容高深莫測、專業詞匯多且與實際聯系不夠緊密，造成學生在學習過程中困難重重，嚴重降低了學生對該學科學習的積極性。（2）教學條件限制。在分子生物學課堂中，使用多媒體設備等教學手段對提高學生的學習積極性以及學習效果有明顯的促進作用。然而，部分教學單位由于教育資源分布不均勻，難以利用先進的教學手段。（3）分子生物學課程所涉及的知識點以及生物學過程，大多數是看不見摸不著的微觀世界，學生在學習的過程中難以直觀感受。（4）理論知識更新快，實驗技術發展快。分子生物學作為生命科學的前沿學科，其發展日新月異，這也對教學提出了更高的要求。授課老師需及時接納最新知識，充分備課。

2分子生物學教學改革的主要措施

2.1PBL教學法的合理運用

PBL（problem-basedlearning，問題式學習）教學法于1969年由美國Barrows教授創立，并引入高等教育，很快在高校中廣泛應用。是一種以問題為導向，以學生為中心的教學方法。其主要流程是：老師提出問題，學生作為主體進行分組討論，學生解決問題。[3]在PBL教學過程中，學生是主體，老師則主要起到輔導的作用。分子生物學課程內容復雜，用傳統的教學方式不易調動學生的學習積極性，而且課堂效率不高。在課堂中適當引入PBL教學法，可改善教師唱獨角戲，學生被動接受的狀況。在進行PBL教學前的備課過程中，任課老師應查閱大量的文獻，充分考慮在討論案例過程中可能出現的問題，內容涉及分子生物學以及其他學科如生物化學、細胞生物學等。在課堂上，教師應寓教于樂，充分調動學生積極性，控制好課堂節奏，同時應根據教學大綱的安排，強調學習過程中應掌握的知識要點。[4]在分子生物學的教學過程中，PBL教學可分為四個階段：（1）提出問題。開展PBL教學的時間不宜在課程開始的階段，而應在課程中后期，學生具有一定的分子生物學基礎后再開展。PBL教學討論的主要題目應該是分子生物學教學過程中的重點或者難點，并且結合生活實際的討論內容。教師在這個過程中是組織者的身份。（2）人員組成。為調動學生參與的積極性，同時考慮到團隊的高效性，將每個班級分成4~6組，每組包括4~6名同學。分組結束后，要求各組成員選拔出該組的組長并選定擬解決的問題，然后進行人員的分工，明確每個成員應完成的內容和時間節點。老師負責全程把控，掌握教學的整體節奏與進展，及時了解各組的情況，包括進程、主要觀點、存在問題、后續進展等。鼓勵各組結合自己的研究、思考提出自己的想法。對成效較好的小組，給予肯定和表揚；對存在問題較多或進展較慢的小組有針對性的指導，幫助小組找到解決問題的核心路徑。（3）成果展示。學生展示自己的研究成果，并開展充分討論。主講老師在學生討論完畢后，對學生的成果、討論的主題、各組的亮點、學生關注點較集中或爭議較大的問題、學生未掌握到的知識點、研究時未關注的部分、下一步學習或研究中需要改進的研究方法進行總結、歸納，并提出改進意見。[5]（4）考核評分。考核評分是對PBL學生成果的集中體現，評分體系主要包括三部分：一是課件制作，占比30%，評價標準主要是內容正確、重點突出、課件美觀、清晰易懂，能綜合運用圖片、音頻、視頻、動畫等表達自己的觀點；二是課件展示，占比40%，準備充分、邏輯正確、條理分明、落落大分，能清晰的闡述自己的研究成果、觀點等；三是課堂討論：占比30%，主動思考，積極參與，能夠拋出富有啟發意義的論點，回答問題時中肯全面。

2.2提倡分組討論，開展小班教學

在討論課開始前2周，老師將要討論的內容告知學生。以小組為單位進行學習，各小組成員間可以進行分工協作，分頭尋找資料、討論并匯總；課堂上以小組形式提出問題，介紹小組觀點、結論，老師也會對該小組的匯報進行點評；課后以小組為單位進行復習，增強學習效果。小組學習活動的意義既體現個人的價值和責任，更強調成員間彼此賦予信心和力量，通過體驗團隊的智慧和協作，培養了學生間可貴的團隊合作精神。分子生物學的課堂提倡小班教學。一方面，可以增加師生間互動的頻率。由于分子生物學課程所涉及的知識點以及生物學過程，大多數是看不見摸不著的微觀世界，學生在學習的過程中難以直觀感受，這就增加了學生學習該課程的難度。小班教學有助于老師關注每一個學生對相關知識的把握；另一方面，小班教學易于實施多種教學形式，靈活掌握教學要求和進度，便于及時調整教學內容。

2.3利用網絡資源，提升自主學習能力

自主學習強調的學生作為知識的主動構造者自己進行學習的意愿和能力，反映了教學向個性化、創新化、自主化、多元化過渡的趨勢。分子生物學作為前沿科學，信息量大、更新快，要積極利用互聯網信息資源，提升學生學習和借鑒優秀研究成果、自主學習的能力。教師要由照著教材講變成開放式、啟發式教學，最大限度調動學生學習的積極性、思考的主動性、課堂的參與性。鼓勵學生自主學習，主動去學習和研究當前科研的最前沿知識，在研究的過程中敢于提出自己不同的看法，培養學生探索創新精神。[6]讓學生由被動受教變成自主學習，主動參與到課堂學習中，形成教學工作“教”與“學”相輔相成、相互促進。教師要積極拓展教學內容的外延，主動介紹國內外優秀的生物網站、資源庫、期刊、論壇等，鼓勵學生積極開展課外閱讀，豐富學科專業知識、前沿信息、專業詞匯等知識，激發學生探索新知識的熱情，也不斷培養學生自主學習、發現問題、解決問題的能力。[7]

2.4建立形成性評價體系

“形成性評價”的概念是由斯克里文1967年所著《評價方法論》中首先提出來的，與傳統的“終結性評價”不同，它是對學生的學習過程進行的評價，旨在確認學生的潛力，改進和發展學生的學習。因此，形成性評價方式更能體現出學生的學習效果。[8]分子生物學課程的目的在于培養學生形成良好的分子生物學學習習慣和實驗習慣，提高他們的科學素養和創新能力。期中或期末考試不能全面真實地反映出學生的真實學習情況，采取形成性評價的方式顯得更加科學和必要。具體如下：一是平時成績，占課程總成績60%，包括課堂考勤，占總成績5%、課堂作業，占總成績10%、課堂提問，占總成績5%、PBL討論會，占總成績10%、實驗考評，占總成績30%。二是期末考試，占課程總成績40%。由于形成性評價是強調過程的評價方式，引導學生重視平時的學習情況，大大減少了學生考前突擊的可能，也更能真實地反映出學生的真實水平。

2.5優化實驗教學體系

分子生物學實驗技術是生物技術專業學生必須掌握的重要基本技能之一。其研究方法及策略已被廣泛應用于生命科學的研究當中。[9]通過對學生實驗技能的培養，一方面有利于將理論教學與實踐教學相結合，豐富教學內容，提升教學的實踐性、實用性、綜合性，便于學生理解和掌握；另一方面，在提升學生綜合素質、學習興趣、創新能力、思考能力等方面也有十分重要的作用。[10]因此，增加分子生物學實驗學時數，開展綜合實驗也是課程改進的一個重要方向。在實驗教學中，教師要結合分子生物學快速發展的特點，選取與教學內容相適應的操作性、設計性實驗，并做好不同實驗之間的關聯與銜接，建立實驗的邏輯體系。一是分組分工，輔助實驗老師提前做好實驗準備工，并提前觀察、發現問題及時記錄。二是教師針對前期準備工作中發現的問題有針對性的闡述，并對實驗流程、操作方法、各環節中注意事項進行講解與演示，指導學生開展實驗。三是講解與演示結束后，學生動手實驗，教師應注意注意觀察過程和細節，對共性問題，要及時統一糾正，對個別同學的個性問題，要個別指導。既確保操作的準確性、嚴謹性，也要保證實驗質量，通過實驗檢驗教學情況。

3結語

生物技術專業應用人才培養是一個綜合性、系統性的工程，涉及到教育環節的方方面面。課程教學是其重要的一環，分子生物學課程教師要積極發揮作用，不斷提升專業能力、教學能力，教學理念與時俱進、教學手段豐富靈活，激發學生學習的主動性、創造性，提升學習內容掌握能力及應用效果，為國家培養知識、能力、素質協調統一的應用性、復合型人才。

參考文獻

[1]朱玉賢,李毅,鄭曉峰等.現代分子生物學(第四版)[M].北京:高等教育出版社,2013.