前言：中文期刊網(wǎng)精心挑選了細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷程范文供你參考和學(xué)習(xí)，希望我們的參考范文能激發(fā)你的文章創(chuàng)作靈感，歡迎閱讀。

細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷程范文1

關(guān)鍵詞：生物工程;微生物學(xué);教學(xué)改革

中圖分類號(hào)：G642.0 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1674-9324（2016）05-0056-02

微生物學(xué)如今已經(jīng)成為生命科學(xué)類大學(xué)生必須學(xué)習(xí)、掌握的基礎(chǔ)課之一，它的主要任務(wù)是使學(xué)生系統(tǒng)掌握微生物學(xué)基礎(chǔ)知識(shí)、理論和實(shí)踐操作技能[1]。要提高該課程的教學(xué)質(zhì)量，應(yīng)緊密跟蹤國(guó)際最新前沿，選用和參考國(guó)內(nèi)外優(yōu)秀教材及研究工具書(shū)，從教材建設(shè)、課程內(nèi)容、教學(xué)方法等方面進(jìn)行改革，使課程緊跟學(xué)科發(fā)展的步伐，使學(xué)生及時(shí)掌握最新的微生物學(xué)理論知識(shí)和應(yīng)用技術(shù)。本文以生物工程專業(yè)為例，從教學(xué)內(nèi)容、教學(xué)方法等方面對(duì)《微生物學(xué)》課程教學(xué)改革進(jìn)行探討和思考。

一、教學(xué)內(nèi)容的改革

（一）教材的選擇

目前，國(guó)內(nèi)微生物課程有關(guān)的教材，其主要內(nèi)容包括微生物的形態(tài)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能、營(yíng)養(yǎng)、生長(zhǎng)與控制等[2]。考慮到學(xué)生已有的知識(shí)基礎(chǔ)，確定選用高等教育出版社出版的《微生物學(xué)》（第二版）這本書(shū)作為教材。這本書(shū)章節(jié)分類明確，內(nèi)容全面，措辭嚴(yán)謹(jǐn)，重點(diǎn)、難點(diǎn)突出，且有助于內(nèi)容選擇和安排，因此可較好滿足理論教學(xué)要求。此外，由Pearson Education Inc.出版、Michael T. Madigan等編寫(xiě)的《Brock's Biology of Microorganism 13ed》一書(shū)，則作為本課程的主要參考書(shū)，該參考書(shū)信息量十分豐富全面，知識(shí)概念嚴(yán)謹(jǐn)，而且有諸多國(guó)內(nèi)其他同類教材所不具備的彩圖多幅，展現(xiàn)了微生物學(xué)的誘人前景，引導(dǎo)學(xué)生投身微生物學(xué)領(lǐng)域的研究，是一部不可多得的優(yōu)良工具書(shū)。

（二）優(yōu)化重點(diǎn)，避免重復(fù)

在教學(xué)中，應(yīng)根據(jù)選定教材的特點(diǎn)和各個(gè)章節(jié)內(nèi)容的難易程度，合理分配不同章節(jié)的學(xué)時(shí)數(shù)。對(duì)在別的課程中涉及到的內(nèi)容盡量少講或者不講，如《生物化學(xué)》、《細(xì)胞生物學(xué)》和《基因工程》課程中涉及的部分內(nèi)容可以不講，以便重點(diǎn)突出的安排教學(xué)內(nèi)容。

例如，微生物包含了原核微生物、真核微生物和病毒三類，在講到微生物的細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能一章，由于同期開(kāi)設(shè)的《細(xì)胞生物學(xué)》課程詳細(xì)介紹了真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)，所以在微生物學(xué)課程重點(diǎn)講述原核細(xì)胞，真核細(xì)胞結(jié)構(gòu)只講代表性微生物如酵母、霉菌的細(xì)胞形態(tài)。再如講到微生物的代謝一章，由于《生物化學(xué)》課程會(huì)講到通用的生物代謝途徑，如氨基酸、核苷酸和糖類的合成途徑，這些生化代謝在微生物學(xué)課程里就不重復(fù)介紹了，而重點(diǎn)介紹各種在微生物中獨(dú)具或占主導(dǎo)地位的分解或合成途徑，解釋其重要的生理功能，引導(dǎo)出各種微生物工業(yè)發(fā)酵的產(chǎn)品。還比如，講到微生物基因表達(dá)調(diào)控和微生物與基因工程這兩章，由于這兩章內(nèi)容實(shí)際應(yīng)是《基因工程原理》和《基因表達(dá)調(diào)控》課程的主要內(nèi)容，所以在本課程中也不宜作過(guò)細(xì)的介紹，而應(yīng)該重點(diǎn)描述微生物在基因工程研究過(guò)程中起到的重要作用，使學(xué)生明確基因工程的發(fā)生發(fā)展是離不開(kāi)微生物的。在講基因表達(dá)調(diào)控時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)放在原核微生物轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)控，突出微生物學(xué)課程的特色和重點(diǎn)。

（三）科學(xué)安排

緒論是第一章，萬(wàn)事開(kāi)頭難，先講好緒論十分關(guān)鍵。緒論概述了微生物的定義、發(fā)展歷程、對(duì)人類的影響及發(fā)展趨勢(shì)等內(nèi)容。講授中以人物和事件為主線，介紹微生物學(xué)發(fā)展的重要?dú)v史階段、關(guān)鍵人物以及微生物在各個(gè)生產(chǎn)領(lǐng)域中的應(yīng)用，激發(fā)學(xué)生對(duì)課程的學(xué)習(xí)興趣。例如，通過(guò)介紹列文虎克給英女王看顯微鏡的故事、巴斯德研究蠶病和制備疫苗的故事以及柯赫、弗萊明的主要貢獻(xiàn)等內(nèi)容，使學(xué)生在理解微生物學(xué)發(fā)展歷程的同時(shí)，直觀的感受前人認(rèn)真觀察和持之以恒的科學(xué)精神。人類目前仍然面對(duì)著多種細(xì)菌和病毒為病原體的傳染病威脅，另外環(huán)境污染物的生物降解、沼氣氫氣等新能源的開(kāi)發(fā)問(wèn)題，也都與微生物密切相關(guān)。闡述以上內(nèi)容，可使學(xué)生明確微生物與人類的密切相關(guān)性以及人類認(rèn)識(shí)并改造微生物進(jìn)而為社會(huì)服務(wù)的實(shí)踐過(guò)程，從而端正學(xué)習(xí)態(tài)度，樹(shù)立堅(jiān)定的目標(biāo)，積極投入到之后的微生物學(xué)課程學(xué)習(xí)中。

緒論之后進(jìn)入微生物學(xué)各專題的分章介紹，根據(jù)講授內(nèi)容的豐富程度、知識(shí)難易程度，應(yīng)該有學(xué)時(shí)分配上的差異。結(jié)構(gòu)與功能、代謝、生長(zhǎng)與控制、病毒、生態(tài)進(jìn)化和物種多樣性這幾章，描述性內(nèi)容較多，概念名詞豐富，應(yīng)采用圖片和動(dòng)畫(huà)插放的多媒體教學(xué)方式，使學(xué)生有直觀的感性認(rèn)識(shí)，便于他們記憶;遺傳、基因表達(dá)調(diào)控和基因工程這三章，涉及到較多分子遺傳學(xué)的知識(shí)，且與其他章節(jié)的銜接性不大，講授時(shí)應(yīng)該與教材上的章節(jié)排列順序有所區(qū)別。例如，可以將這三章內(nèi)容放在進(jìn)化和物種多樣性一章結(jié)束后再講，這樣會(huì)使知識(shí)銜接更好，同時(shí)也使學(xué)習(xí)的難易程度由容易逐漸過(guò)渡到難，符合學(xué)生掌握知識(shí)過(guò)程的客觀規(guī)律。

二、教學(xué)方法的改革

（一）充分利用多媒體

微生物學(xué)課程涉及大量微生物形態(tài)和結(jié)構(gòu)的介紹，以及較復(fù)雜的代謝反應(yīng)流程。傳統(tǒng)的教學(xué)方法以文字講授為主，輔以十分有限且質(zhì)量較差的圖片資料，教學(xué)效果不理想[3]。因此，在教學(xué)過(guò)程中合理使用多媒體工具，把抽象性的教學(xué)內(nèi)容轉(zhuǎn)變?yōu)樯鷦?dòng)形象的感性素材來(lái)提高教學(xué)質(zhì)量，是十分必要的。我們的教學(xué)實(shí)踐表明，多媒體教學(xué)這一直觀、準(zhǔn)確、豐富、生動(dòng)的教學(xué)方式，在擴(kuò)大了教學(xué)內(nèi)容信息量、避免乏味的照本宣科的同時(shí)，從根本上提高了學(xué)生的聽(tīng)課效率和課后的學(xué)習(xí)興趣。

多媒體教學(xué)的另一大優(yōu)勢(shì)是電子教案可以瞬時(shí)拷貝，這個(gè)優(yōu)點(diǎn)可促使學(xué)生上課時(shí)專心聽(tīng)講，以免發(fā)生因做筆記而漏聽(tīng)或漏記了上課內(nèi)容的情形。而且現(xiàn)成的教案相比學(xué)生自行記錄的筆記內(nèi)容而言，有知識(shí)的準(zhǔn)確率高和字體的清晰度好等優(yōu)點(diǎn)。因此，多媒體教學(xué)最大限度地突破了傳統(tǒng)教學(xué)的束縛，在提高教學(xué)質(zhì)量、減輕學(xué)生的學(xué)習(xí)壓力和突出學(xué)生的人本效應(yīng)等方面起了十分重要的作用。

（二）開(kāi)展課堂討論

為了克服學(xué)生上課開(kāi)小差不專心聽(tīng)講的常見(jiàn)缺點(diǎn)，充分調(diào)動(dòng)學(xué)生主觀能動(dòng)性的同時(shí)并活躍課堂的教學(xué)氣氛，在課堂上可安排數(shù)次短時(shí)間的討論。因?yàn)橛懻摯偈箤W(xué)生主動(dòng)思考，通過(guò)活躍的聽(tīng)力和口語(yǔ)交流，提高其分析和解決問(wèn)題的能力[4]。討論的形式是由老師課前布置習(xí)題，學(xué)生查閱資料完成作業(yè)，教師批改作業(yè)之后，根據(jù)回答內(nèi)容進(jìn)行分類，然后在下一次課的開(kāi)始將作業(yè)題的幾個(gè)不同答案在課堂上進(jìn)行討論，使每個(gè)學(xué)生都能參與其中，然后最后由教師對(duì)正確答案進(jìn)行講解。課后學(xué)生們反映這種上課形式好，既提高了學(xué)習(xí)興趣，又加深了對(duì)知識(shí)點(diǎn)的理解。

（三）考核方式的多元化

將學(xué)生的課程最終成績(jī)分為平時(shí)成績(jī)和期末成績(jī)。在計(jì)算最終成績(jī)時(shí)，期末成績(jī)占總成績(jī)的80%，平時(shí)成績(jī)占20%。期末成績(jī)指考試的卷面成績(jī)，平時(shí)成績(jī)里面，平時(shí)作業(yè)占50分，學(xué)習(xí)交流（包括課堂問(wèn)答、個(gè)別交流、參與討論）占30分，課程學(xué)習(xí)筆記20分。通過(guò)考核方式的多樣化，使學(xué)生成績(jī)?cè)u(píng)定更為客觀準(zhǔn)確，也提高了學(xué)生各方面學(xué)習(xí)的綜合素質(zhì)。

（四）將自己的科研成果融于課堂，提升個(gè)人素質(zhì)

筆者在講授微生物學(xué)課程的同時(shí)，課余時(shí)間一直從事環(huán)境微生物學(xué)方面的科學(xué)研究，因此對(duì)當(dāng)前微生物學(xué)研究的國(guó)際前沿或多或少有所了解。生命科學(xué)被譽(yù)為21世紀(jì)的領(lǐng)頭學(xué)科，其科學(xué)研究的發(fā)展日新月異。將相關(guān)領(lǐng)域的國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展引入到課堂相關(guān)知識(shí)講授的過(guò)程中，可以使青年學(xué)生及時(shí)了解知識(shí)的更新程度和全面、重要程度，對(duì)提高學(xué)生的聽(tīng)課積極性和學(xué)習(xí)甚至研究的主觀能動(dòng)性，也是十分有幫助的。例如，在講授細(xì)菌S層的結(jié)構(gòu)時(shí)，結(jié)合自己分離菌株的電鏡照片、相關(guān)功能基因克隆以及在大腸桿菌中異源表達(dá)，使學(xué)生對(duì)該結(jié)構(gòu)的重要性和在技術(shù)領(lǐng)域的應(yīng)用潛力有一個(gè)很全面的了解;在講授氨基酸的合成代謝時(shí)，結(jié)合自身研究的谷氨酰胺合成酶基因克隆和轉(zhuǎn)基因植物的生化分析，了解各種氨基酸合成和運(yùn)輸過(guò)程，以及它們?cè)谖⑸矬w內(nèi)的代謝路徑;講授微生物的多樣性時(shí)，引入筆者研究過(guò)的沼氣池樣本產(chǎn)甲烷古菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析，明確這類古生菌在自然界的分布及其在自然生態(tài)系統(tǒng)中所起的重要生物學(xué)功能。除了教學(xué)方法的改革外，同時(shí)加強(qiáng)自身的思想修養(yǎng)和職業(yè)道德修養(yǎng)，提升教師的各方面素質(zhì)也不可忽視。不僅在教學(xué)過(guò)程中要激發(fā)學(xué)生的學(xué)習(xí)興趣以取得最優(yōu)的教學(xué)效果，還要做到多與學(xué)生交流，及時(shí)了解學(xué)生的正確想法和思想上的困惑，鼓勵(lì)學(xué)生熱愛(ài)學(xué)習(xí)，釀造和培育大學(xué)課堂上教師與學(xué)生生動(dòng)活潑、互相促進(jìn)的良好氛圍。

三、結(jié)語(yǔ)

當(dāng)前世界已處于信息化時(shí)代，知識(shí)的更新快、信息量大。這改變了人們傳統(tǒng)的學(xué)習(xí)方式，也對(duì)大學(xué)微生物學(xué)的課程教學(xué)產(chǎn)生了深刻影響。因此，必須改革傳統(tǒng)的教學(xué)內(nèi)容和手段，建立新的教學(xué)理念。在更新教學(xué)內(nèi)容的同時(shí)，應(yīng)重點(diǎn)培養(yǎng)學(xué)生掌握科學(xué)的方法、自身創(chuàng)新能力和個(gè)人綜合素質(zhì)。微生物學(xué)的發(fā)展日新月異，教學(xué)改革勢(shì)在必行，這既是培養(yǎng)創(chuàng)新人才的需要，也是現(xiàn)代社會(huì)對(duì)高等教育人才的時(shí)代需要，是每個(gè)教育工作者的職責(zé)所在。在教學(xué)過(guò)程中，只有把知識(shí)傳授和能力培養(yǎng)有機(jī)地結(jié)合起來(lái)，同時(shí)提高教學(xué)效果，才能使學(xué)生成為適應(yīng)未來(lái)實(shí)際發(fā)展需要的高技術(shù)、創(chuàng)新型人才。

參考文獻(xiàn)：

[1]沈萍，陳向東.微生物學(xué)復(fù)興的機(jī)遇、挑戰(zhàn)和趨勢(shì)[J].微生物學(xué)報(bào)，2010，50（1）：1-6.

[2]高明華，張志琰，樊慶德，徐春光，李艷.微生物學(xué).課堂教學(xué)改革與實(shí)踐[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（6）：3776-3777.

細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷程范文2

王遠(yuǎn)亮教授是一位頗有成就的科學(xué)工作者。他認(rèn)為,祖國(guó)在科學(xué)工作者的心中是神圣的,因此時(shí)刻惦記著要為祖國(guó)的騰飛多做貢獻(xiàn)。在“科學(xué)技術(shù)是第一生產(chǎn)力”的今天如何多做貢獻(xiàn),就成為科學(xué)工作者常常默默思考的問(wèn)題。

現(xiàn)代科學(xué)知識(shí)增長(zhǎng)迅猛,科學(xué)技術(shù)發(fā)展飛速,我們的祖國(guó)正在按照科學(xué)發(fā)展觀建設(shè)有中國(guó)特色社會(huì)主義創(chuàng)新型國(guó)家。顯然中國(guó)特色社會(huì)主義國(guó)家的科學(xué)發(fā)展體系,需要中國(guó)特色的社會(huì)主義政治體系、科學(xué)技術(shù)體系、經(jīng)濟(jì)體系、教育體系、社會(huì)保障體系等等。然而,中國(guó)的科學(xué)技術(shù)體系如何建立才可以再創(chuàng)中國(guó)的科學(xué)技術(shù)偉大輝煌?這是中國(guó)科技工作者的歷史使命。

現(xiàn)代科技體系基本上是按照西方科技體系建立的,是否具備中國(guó)特色?是值得深思與探討的問(wèn)題。

由此可見(jiàn),王遠(yuǎn)亮教授是個(gè)善于思考的人,他能在生物工程學(xué)方面取得輝煌成就也與他善于思考是密不可分的。

善于分析系統(tǒng)把握

迄今,現(xiàn)代西方的科學(xué)知識(shí)尤其是在物質(zhì)科學(xué)和生命科學(xué)領(lǐng)域增長(zhǎng)之迅猛,微粒子,時(shí)空量子化,特別是基于分子生物學(xué)的醫(yī)學(xué)的知識(shí)等等,日新月異,預(yù)示著科學(xué)將產(chǎn)生巨大的變革。我們正處在科學(xué)變革的前夜。在這種背景下,我們?nèi)绾谓ㄔO(shè)中國(guó)特色社會(huì)主義國(guó)家的科學(xué)技術(shù)體系?王遠(yuǎn)亮教授認(rèn)為需要冷靜地系統(tǒng)分析。

我國(guó)現(xiàn)實(shí)的狀況是,西學(xué)東遷并且?guī)缀跞P(pán)西化(部分真正的中醫(yī)除外)的科學(xué)技術(shù)體系似乎已經(jīng)形成。其理由是,西方科學(xué)就是先進(jìn)。西方技術(shù)的先進(jìn)性有目共睹,為何古代中國(guó)科學(xué)那么的輝煌,近代就落后了呢?

這也就十分奇怪了,表面上看這是所謂的“李約瑟疑難”,實(shí)際上是人們賴以“假設(shè)+邏輯思維與推理”,有時(shí)輔以局部關(guān)系的實(shí)驗(yàn),即注重非真實(shí)性的科學(xué)(西方科學(xué)是必須以假設(shè)為前提的科學(xué)),卻很少關(guān)注真實(shí)性的科學(xué)(中國(guó)古代創(chuàng)立的科學(xué)是不需要假設(shè)的科學(xué))。可是史蒂芬•科維認(rèn)為需要“根據(jù)德?tīng)柤{的觀點(diǎn),避免失敗的關(guān)鍵在于要用系統(tǒng),而不要用分量;要以整體,而不要以局部的方式進(jìn)行思維。”這正好符合中國(guó)先前輝煌的科學(xué)觀。所以不必奇怪,西方科學(xué)家正在改變自己的思維方式,大勢(shì)在中國(guó)先哲科學(xué)觀領(lǐng)域中淘寶。有很多外國(guó)人在中國(guó)這里得到了啟示,比如說(shuō),玻爾以“太極圖”作為族徽,普里高津在湖南學(xué)習(xí)了“天人合一”繼而發(fā)現(xiàn)了開(kāi)放式非平衡系統(tǒng)科學(xué),湯川秀樹(shù)認(rèn)為他之所以能提出介子理論與受到莊子餛飩說(shuō)的啟示有關(guān),哈肯說(shuō)“協(xié)同學(xué)和中國(guó)古代思想整體性觀念上有很深的聯(lián)系。”等等,由此可見(jiàn),中國(guó)的先哲科學(xué)觀領(lǐng)域是有很多精華的,后人需要的就是將這些精華加以提煉并正確運(yùn)用和發(fā)展,形成屬于中國(guó)自己的科學(xué)系統(tǒng)。

愛(ài)因斯坦說(shuō):“西方科學(xué)的發(fā)展是以兩個(gè)偉大的成就為基礎(chǔ)的,那就是:希臘哲學(xué)家所發(fā)明的形式邏輯體系(在歐幾里德幾何中),以及發(fā)現(xiàn)通過(guò)系統(tǒng)的實(shí)驗(yàn)可能找出因果關(guān)系(在文藝復(fù)興時(shí)期)的方式方法。中國(guó)的賢哲沒(méi)有走上這兩步,那是不用奇怪的。令人驚奇的倒是這些發(fā)現(xiàn)(在中國(guó))全部都做出來(lái)了。”但值得欣慰的是,我國(guó)很多中西會(huì)通者都發(fā)現(xiàn)了這一影響我國(guó)科學(xué)事業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵因素. 著名數(shù)學(xué)家陳省身在1994年吳文俊榮獲香港求是科技基金會(huì)頒發(fā)的杰出科學(xué)家獎(jiǎng)時(shí)說(shuō):“他的機(jī)器證明理論,保持了中國(guó)數(shù)學(xué)的傳統(tǒng)。”同時(shí),吳文俊院士也說(shuō):“最重要的是開(kāi)拓屬于我們自己的領(lǐng)域,創(chuàng)造自己地方法,提出自己的問(wèn)題。這就好像別人已經(jīng)開(kāi)辟出一片天地,你在這片天地中,即使翻江倒海、苦心經(jīng)營(yíng),也很難超過(guò)人家,這片天地終究是人家的”。特別是吳文俊在《中國(guó)古代數(shù)學(xué)對(duì)世界文化的偉大貢獻(xiàn)》一文中明確指出“近代數(shù)學(xué)之所以能夠發(fā)展到今天,主要是靠中國(guó)的數(shù)學(xué),而非希臘的數(shù)學(xué),決定數(shù)學(xué)歷史進(jìn)程的主要是靠中國(guó)的數(shù)學(xué),而非希臘的數(shù)學(xué)。”

王遠(yuǎn)亮教授認(rèn)為,我們應(yīng)該以吳文俊先生為榜樣,正視中國(guó)的歷史至今的科學(xué)發(fā)展歷程,《老子》以系統(tǒng)科學(xué)觀論長(zhǎng)壽之道可以借鑒;《易》學(xué)以系統(tǒng)科學(xué)觀述太陽(yáng)系形成論;中醫(yī)秉承這兩個(gè)系統(tǒng)思維保障人體健康;現(xiàn)代西方科學(xué)的非線主要靠中國(guó)的系統(tǒng)科學(xué)去解決,那么未來(lái)的科學(xué)應(yīng)該是以中國(guó)系統(tǒng)思維的科學(xué)為基調(diào)的科學(xué)。

所以,王遠(yuǎn)亮教授認(rèn)為,以我國(guó)的系統(tǒng)科學(xué)思維去融匯中西,就能夠建成世界上最先進(jìn)的中國(guó)特色的科學(xué)技術(shù)體系,以此建成“中國(guó)特色社會(huì)主義”的完美大廈。

樸實(shí)無(wú)華耕耘收獲

我們知道,生物工程學(xué)起源于20世紀(jì)70年代初,在分子生物學(xué)、細(xì)胞生物學(xué)等的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的,包括基因工程、細(xì)胞工程、酶工程、發(fā)酵工程等,他們互相聯(lián)系,其中以基因工程為基礎(chǔ)。只有通過(guò)基因工程對(duì)生物進(jìn)行改造,才有可能按人類的愿望生產(chǎn)出更多更好的生物產(chǎn)品。而基因工程的成果也只有通過(guò)發(fā)酵等工程才有可能轉(zhuǎn)化為產(chǎn)品。

醫(yī)學(xué)上通過(guò)生物工程可以生產(chǎn)出大量廉價(jià)的防治人類疾病的藥物,如入胰島素、干擾素、生長(zhǎng)激素、乙型肝炎疫苗等。生物工程在食品、輕工中的應(yīng)用面也很廣。

現(xiàn)在世界各國(guó)對(duì)生物工程都十分重視,我國(guó)也把生物工程列為重點(diǎn)發(fā)展的科研項(xiàng)目之一。生物工程學(xué)的研究將對(duì)人類的生產(chǎn)方式和生活方式產(chǎn)生巨大的影響。

王遠(yuǎn)亮教授看到了生物工程對(duì)人類的影響,義無(wú)反顧的投身到這項(xiàng)偉大的事業(yè)當(dāng)中,多年以來(lái),王遠(yuǎn)亮教授兢兢業(yè)業(yè)的從事研究工作,進(jìn)行了多個(gè)課題的研究,并取得了驕人的成果。他一直從事聚乳酸改性材料及其應(yīng)用基礎(chǔ)研究,曾負(fù)責(zé)并完成與本課題有關(guān)的項(xiàng)目30多項(xiàng),包括負(fù)責(zé)和參加的國(guó)家自然科學(xué)基金面上和重點(diǎn)項(xiàng)目8項(xiàng),負(fù)責(zé)和參加國(guó)家“863計(jì)劃”課題2項(xiàng),主持國(guó)家支撐計(jì)劃項(xiàng)目1項(xiàng),此外還有教育部和重慶市重點(diǎn)重大科技課題8項(xiàng)。獲得了多項(xiàng)榮譽(yù)。

細(xì)胞生物學(xué)的發(fā)展歷程范文3

關(guān)鍵詞：反義RNA；RNA干擾；ZFN；TALEN；CRISPR-Cas系統(tǒng)

中圖分類號(hào)：Q78 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A 文章編號(hào)：0439-8114（2017）08-1405-08

DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2017.08.002

Research Progress on Loss of Gene Function Technologies

NING Hui-yua，b，LIU Caia，b，ZOU Hua-wena，b

（a.College of Agriculture；b.Hubei Collaborative Innovation Center for Grain Industry，Yangtze University，Jingzhou 434025，Hubei，China）

Abstract： Loss of gene function technology is one of the most important and efficient methods to study gene function at present. Now main widely used loss of gene function technologies are anti-sense RNA， RNA interference，ZFN，TALEN，CRISPR-Cas nucleases technology and so on. Those technologies aim to inhibiting or turning off the expression of the target gene， researching the change of the biological phenotype， and thus their related functions were speculated. In the practical studies， loss of gene function is always along with gene overexpression， providing the most direct evidence for gene function research， which was widely used in biology， medicine， agriculture and other fields. This paper systematically introduces the developing history， technological principles and application of some common loss of gene function technologies， and the protest of their future research and application is introduced.

Key words： anti-sense RNA； RNA interference； ZFN； TALEN； CRISPR-Cas nucleases

20世o50年代DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的發(fā)現(xiàn)，標(biāo)志著人們對(duì)生命科學(xué)的研究進(jìn)入了分子生物學(xué)時(shí)代。隨著后基因組時(shí)代的到來(lái)，基因組學(xué)的研究重心從揭示生命的所有遺傳信息結(jié)構(gòu)、組成等轉(zhuǎn)移到對(duì)功能的研究上。除了傳統(tǒng)的轉(zhuǎn)基因（基因過(guò)量表達(dá)）外，定向抑制或完全消除特定基因的表達(dá)也是目前研究基因生物學(xué)功能的重要手段。因此，出現(xiàn)了反義RNA、RNA干擾等技術(shù)。隨著研究技術(shù)手段的發(fā)展，近年來(lái)又興起了ZFN技術(shù)、TALEN技術(shù)、CRISPR-Cas系統(tǒng)等基因功能修飾技術(shù)。這些技術(shù)不斷被發(fā)現(xiàn)及應(yīng)用，極大地促進(jìn)了生物學(xué)研究的發(fā)展。本研究主要對(duì)基因功能缺失技術(shù)發(fā)展歷程、技術(shù)原理及應(yīng)用等方面進(jìn)行概述。

1 反義RNA技術(shù)

反義RNA是指與靶RNA（多為mRNA）具有互補(bǔ)序列的RNA分子，它通過(guò)與靶RNA進(jìn)行堿基互補(bǔ)配對(duì)的結(jié)合方式影響mRNA的后續(xù)翻譯過(guò)程。反義RNA最早在原核生物E.coli的產(chǎn)腸桿菌素的Col E1質(zhì)粒中發(fā)現(xiàn)[1]。隨后發(fā)現(xiàn)在真核生物中也存在天然的反義RNA，特別是發(fā)現(xiàn)了人工構(gòu)建的反義寡核苷酸在真核生物中具有生物學(xué)效應(yīng)以來(lái)，反義RNA技術(shù)已成為一種直接有效的人為控制基因表達(dá)的方法，并且倍受生物學(xué)界關(guān)注。

1.1 反義RNA作用機(jī)理

反義RNA主要通過(guò)與靶RNA以堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式結(jié)合，參與基因表達(dá)調(diào)控。其作用機(jī)理為：①在DNA復(fù)制水平上。反義RNA通過(guò)與DNA復(fù)制時(shí)的起始引物RNA結(jié)合，阻止RNA引物與模板DNA的結(jié)合，抑制DNA的復(fù)制。②在轉(zhuǎn)錄水平上。反義RNA可以直接與mRNA5′端互補(bǔ)，阻止轉(zhuǎn)錄。③在翻譯水平上。反義RNA通過(guò)與mRNA上的特定序列互補(bǔ)配對(duì)而結(jié)合。結(jié)合位置包括起始密碼子AUG、靶mRNA的非編碼區(qū)、原核生物的SD序列以及真核生物的mRNA5′端，從而直接或間接地抑制mRNA的翻譯[2]。

1.2 反義RNA技術(shù)的應(yīng)用

目前，反義RNA技術(shù)作為一種重要的基因調(diào)控手段，在植物、病毒、細(xì)菌中得到廣泛應(yīng)用。在植物中最顯著的應(yīng)用是果實(shí)成熟的控制。科學(xué)家通過(guò)控制乙烯合成途徑中的關(guān)鍵酶來(lái)限制乙烯的合成，從而達(dá)到控制果實(shí)成熟的目的[3]。Oeller等[4]利用反義RNA技術(shù)抑制ACC合成酶的活性，使果實(shí)內(nèi)的乙烯含量被抑制了99.5%。這為果實(shí)的貯藏、加工、運(yùn)輸?shù)忍峁┝诵路椒ā?/p>

反義RNA技術(shù)在植物抗病方面也得到了很好的應(yīng)用。植物病毒是影響植物生長(zhǎng)的重要因素之一。由于DNA病毒和RNA病毒在復(fù)制和表達(dá)的過(guò)程中都要經(jīng)歷RNA生物合成階段，這為利用反義RNA技術(shù)進(jìn)行抗病毒研究提供了理論依據(jù)。Nelson等[5]利用TMV 5′端的基因片段作為目的基因，成功構(gòu)建了反義基因并獲得了表達(dá)反義基因的轉(zhuǎn)基因煙草植株。試驗(yàn)結(jié)果表明，病毒RNA和后代病毒的合成被抑制了25～50倍，病毒侵染癥狀大量減少甚至消失，并且該抗病毒性狀可穩(wěn)定遺傳。

由于抗生素的濫用，細(xì)菌的耐藥性越來(lái)越強(qiáng)。為了能夠快速、簡(jiǎn)便獲得新的抗菌藥物，反義RNA技術(shù)被應(yīng)用到藥物篩選模型上。2006年科學(xué)家在金黃色葡萄球菌體內(nèi)誘導(dǎo)表達(dá)出了針對(duì)單功能脂肪酸合成酶FabF的反義RNA，并構(gòu)建了反義工程菌。研究發(fā)現(xiàn)，構(gòu)建的反義工程菌對(duì)FabF（Fatty acidbiosynthesis geneF）的特異性抑制劑非常敏感，通過(guò)藥物篩選獲得了能夠有效抑制MRSA（Methicillin Resistant Staphylococcus Aureus）和VRE（Vancomycin-Resistant Enterococci）的新型抗生素平板霉素[6]。因此，可利用反義RNA技術(shù)尋找新型抗生素解決細(xì)菌耐藥性的問(wèn)題。

1.3 反義RNA技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

隨著研究的不斷深入，人們對(duì)反義RNA技術(shù)也有了比較成熟的認(rèn)識(shí)。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，反義RNA技術(shù)具有許多的優(yōu)越性。①反義RNA技術(shù)操作較簡(jiǎn)單，適用范圍廣泛。通過(guò)靶mRNA的序列就可以合成所需的反義RNA，可用多個(gè)反義RNA同時(shí)阻斷多個(gè)基因的表達(dá)。②特異性強(qiáng)[7]。反義RNA技術(shù)可以有選擇性的迅速抑制目的基因的表達(dá)。該技術(shù)不會(huì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)生完全抑制，從而能避免致死突變，對(duì)細(xì)胞的正常生長(zhǎng)影響較小。③安全性高[8]。導(dǎo)入細(xì)胞的反義RNA不能被翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)，因此該技術(shù)在基因工程上的應(yīng)用具有很大的安全性。

眾多的因素限制了反義RNA的發(fā)展。主要包括：①成本較高。②靶基因定位困難。由于高等生物的基因組復(fù)雜，對(duì)特殊基因的靶向定位很困難。③使用效率問(wèn)題。反義RNA的堿基序列、含量、靶序列結(jié)合部位和濃度等都會(huì)影響其使用效率[9]。

2 RNA干擾技術(shù)

RNA干擾（RNA interference，RNAi）是指與靶mRNA存在同源互補(bǔ)序列的雙鏈RNA（double-stranded RNA，dsRNA）在細(xì)胞內(nèi)特異性地降解靶mRNA的一種基因轉(zhuǎn)錄后沉默現(xiàn)象[10]。這一現(xiàn)象在自然界中廣泛存在，是生物體在進(jìn)化過(guò)程中形成的一種進(jìn)化上保守的用來(lái)抵御外來(lái)基因或外來(lái)病毒侵犯的防御機(jī)制。

1990年Napoli等[11]將查爾酮合成酶CHS基因轉(zhuǎn)入到牽牛花中，試圖獲得開(kāi)出深紫色花朵的牽牛花，結(jié)果卻得到了白色和斑片狀花朵，即轉(zhuǎn)入的CHS基因和與該基因同源的色素基因的表達(dá)均受到抑制，將這種現(xiàn)象稱為轉(zhuǎn)錄后基因沉默 （Post-transcriptional gene silencing）或者共抑制（Co-suppression）。1994年Cogoni等[12]分別將外源基因albino-1和albino-3轉(zhuǎn)入粗糙脈孢菌（Neurospora）中，也出現(xiàn)了與植物共抑制相同的轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象，將其稱為基因壓制（Gene quelling）現(xiàn)象。1995年Guo等[13]發(fā)現(xiàn)將秀麗新小桿線蟲(chóng)（Caenorhabditis elegans）par-1基因的正義鏈RNA和反義鏈RNA分別注射到線蟲(chóng)體內(nèi)均會(huì)抑制par-1基因的表達(dá)，但當(dāng)時(shí)的理論無(wú)法解釋這一現(xiàn)象。直到1998年Fire等[10]才解釋了這一現(xiàn)象，即RNAi是由于dsRNA引起的轉(zhuǎn)錄后序列特異性基因沉默，并將其命名為基因沉默（Gene silencing）。

2.1 RNA干_作用機(jī)理

RNA干擾作用機(jī)理可分為3個(gè)過(guò)程：siRNA的形成、靶mRNA的降解、RNAi的形成。①siRNA的形成[14]。細(xì)胞質(zhì)中的內(nèi)源性或外源性的長(zhǎng)dsRNA首先與Dicer酶結(jié)合，形成Dicer-dsRNA復(fù)合物，在Dicer酶的RNase的作用下，長(zhǎng)dsRNA被特異性地裂解為21～23 nt siRNA。其5′端為磷酸基，3′端為羥基且含有2個(gè)突出的黏性末端。②靶mRNA的降解。siRNA在解旋酶的作用下解鏈，形成正義鏈和反義鏈，其中的反義鏈可指導(dǎo)形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體（RISC）[15]。在siRNA的引導(dǎo)下，RISC通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別具有同源序列的靶mRNA并進(jìn)行剪切，其剪切位點(diǎn)為與siRNA反義鏈互補(bǔ)的第1個(gè)核苷酸下游的11或12個(gè)核苷酸處，然后降解靶mRNA。③RNAi的形成。在RNA依賴性RNA聚合酶（RdRP）的作用下，以靶mRNA為模板，siRNA為引物，合成dsRNA。合成的dsRNA在Diser酶的作用下，又產(chǎn)生新的siRNA，如此循環(huán)多次，可以使RNAi的作用進(jìn)一步放大。因此，少量的siRNA可以產(chǎn)生高效的基因沉默效應(yīng)[16]。研究還發(fā)現(xiàn)siRNA除了能導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄后基因沉默，還可指導(dǎo)DNA甲基化酶與DNA的特定部位結(jié)合，引發(fā)該特定部位DNA中的胞嘧啶甲基化，導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄水平的基因沉默[17]。

2.2 RNA干擾技術(shù)的應(yīng)用

雖然人們對(duì)RNA干擾的研究只有短短的十幾年時(shí)間，但發(fā)展卻極為迅速，在生物醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。①疾病治療上的應(yīng)用。RNA干擾作為一種基因敲除技術(shù)，在腫瘤、病毒感染、遺傳病治療方面得到了廣泛應(yīng)用。An等[18]利用RNA干擾技術(shù)構(gòu)建了卵巢癌OVCAR3細(xì)胞IGF-IR基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，通過(guò)脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染到人的卵巢癌OVCAR3細(xì)胞中，研究發(fā)現(xiàn)IGF-IR基因的siRNA能顯著抑制其mRNA及蛋白質(zhì)的表達(dá)，并且還能抑制OVCAR3細(xì)胞的增殖。RNA干擾技術(shù)為疾病在基因領(lǐng)域的治療提供了新方法。②作為基因研究的新工具。由于RNA干擾能特異性的抑制目的基因的表達(dá)，根據(jù)其表型等的改變可以分析基因的功能，因此是研究基因功能的一種有效的手段[19]。Yu等[20]通過(guò)構(gòu)建cyclin D1基因的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，研究cyclin D1基因?qū)Π毯鄹泶癯衫w維細(xì)胞的細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的變化。③RNA干擾技術(shù)還被廣泛應(yīng)用于信號(hào)傳導(dǎo)通路的研究。通過(guò)和傳統(tǒng)的缺失突變技術(shù)結(jié)合，RNA干擾技術(shù)可以很容易確定復(fù)雜信號(hào)傳導(dǎo)途徑中不同基因的上下游關(guān)系[21]。Jin等[22]利用RNAi技術(shù)發(fā)現(xiàn)argonaute-1在FMRP參與神經(jīng)元發(fā)育和突觸生長(zhǎng)過(guò)程中起重要作用，證明FMRP能調(diào)節(jié)信號(hào)通路。④藥物的開(kāi)發(fā)與應(yīng)用。RNA干擾可作為尋找和鑒定新藥物靶標(biāo)的工具。利用RNA干擾技術(shù)可以明顯縮短從鑒定到認(rèn)識(shí)藥物靶基因功能的時(shí)間，有助于藥物開(kāi)發(fā)過(guò)程中對(duì)已知靶基因功能的高通量分析[23]。Duff等[24]利用RNA干擾技術(shù)能降低蛋白轉(zhuǎn)移酶9（PCSK9）的表達(dá)量，研究發(fā)現(xiàn)PCSK9表達(dá)量的降低能明顯降低小鼠血清膽固醇水平，說(shuō)明沉默PCSK9可成為治療高膽固醇的藥物靶點(diǎn)。

2.3 RNA干擾技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

RNA干擾技術(shù)具有以下特點(diǎn)：①高效性。RNAi存在級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)。siRNA在Diser酶的作用下，以靶mRNA為模板可以產(chǎn)生新的siRNA，如此循環(huán)多次，可以使RNA干擾的作用進(jìn)一步放大。因此，少量的siRNA可以產(chǎn)生高效的基因沉默效應(yīng)。②特異性。siRNA與靶mRNA通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行結(jié)合，只特異性的誘導(dǎo)靶mRNA的降解。研究表明，即使是一個(gè)堿基的錯(cuò)配，也會(huì)影響靶mRNA沉默效率[25]。對(duì)mRNA前體幾乎沒(méi)有影響，以內(nèi)含子或啟動(dòng)子構(gòu)成的dsRNA也不產(chǎn)生RNA干擾現(xiàn)象。③可傳播和可遺傳性。RNA干擾效應(yīng)可以在不同細(xì)胞間進(jìn)行傳遞，并且可以傳遞到下一代。Fire等[10]通過(guò)將dsRNA注射到線蟲(chóng)體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)dsRNA可以擴(kuò)散到其他細(xì)胞中，并且在下一代也表現(xiàn)出了RNA干擾現(xiàn)象。

目前，對(duì)RNA干擾的研究仍處于初級(jí)階段，還有許多問(wèn)題亟待解決。主要包括：①存在脫靶現(xiàn)象。siRNA可以引起一些非靶基因的非特異性沉默或表達(dá)上調(diào)，抑制細(xì)胞的正常生長(zhǎng)。②穩(wěn)定性差。siRNA導(dǎo)入受體細(xì)胞后RNA干擾效應(yīng)持續(xù)數(shù)天后便會(huì)消失。③載體的安全性問(wèn)題。在臨床應(yīng)用上，載體作為外來(lái)抗原可激活機(jī)體的免疫應(yīng)答，使載體失活，甚至可能對(duì)機(jī)體造成嚴(yán)重的不良后果[26]。

3 鋅指核酸酶（ZFN）技術(shù)

1983年，鋅指蛋白（Zinc finger protein，ZFP）首次在非洲蛙蟾轉(zhuǎn)錄因子IIIA中被發(fā)現(xiàn)。隨著研究的不斷深入，人們對(duì)ZFP有了進(jìn)一步的了解。1996年Kim等[27]將鋅指結(jié)構(gòu)域與IIs型限制性核酸內(nèi)切酶FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域融合，獲得了具有識(shí)別特性的人工合成的核酸內(nèi)切酶。隨后，Bibikova等[28]利用ZFN技術(shù)對(duì)爪蟾的卵母細(xì)胞開(kāi)展外源DNA修復(fù)試驗(yàn)，并取得成功。Bibikova等[29]又利用ZFN技術(shù)成功敲除了果蠅的一個(gè)內(nèi)源基因。ZFN技術(shù)的應(yīng)用實(shí)現(xiàn)了對(duì)基因的高效定點(diǎn)修飾，對(duì)研究基因的功能具有重要意義。

3.1 ZFN的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

ZFN是由鋅指蛋白（ZFP）結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶（FokⅠ）的切割結(jié)構(gòu)域兩部分組成[27]。ZFP結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識(shí)別并特異結(jié)合靶DNA序列。FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)切割靶DNA。

ZFP結(jié)構(gòu)域一般是由3～6個(gè)Cys2-His2型的鋅指結(jié)構(gòu)域串聯(lián)組成，多個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)的串聯(lián)不僅可識(shí)別較長(zhǎng)的靶DNA序列，還可以增加其修飾的特異性。每個(gè)鋅指折疊成α-β-β（C端-N端）型的二級(jí)結(jié)構(gòu)[30]，其中的α螺旋可插入到DNA雙螺旋的大溝，α螺旋中的-1～+6位的7個(gè)氨基酸殘基（+4位通常為亮氨酸殘基）決定了對(duì)靶DNA識(shí)別的特異性[31]。每個(gè)鋅指蛋白可識(shí)別并結(jié)合一個(gè)三聯(lián)體密碼（圖1a）[32]。

FokⅠ是海床黃桿菌（Flavobacterium okeanokoites）表達(dá)的一種限制性內(nèi)切酶，通過(guò)與ZFP的C端融合形成ZFN單體。FokⅠ的切割結(jié)構(gòu)域必須形成二聚體才能發(fā)揮內(nèi)切酶活性[33]。因此，在切割靶位點(diǎn)時(shí)，2個(gè)ZFN單體按照一定的距離和方向同各自的靶DNA鏈特異結(jié)合，2個(gè)FokⅠ切割結(jié)構(gòu)域恰好可形成有活性的二聚體，在2個(gè)結(jié)合位點(diǎn)的間隔區(qū)（Spacer，通常為5～7 bp）切割DNA產(chǎn)生DSB切口。細(xì)胞再通過(guò)非同源性末端接合（NHEJ）或同源重組（HR）等方式對(duì)基因進(jìn)行修復(fù)，改變靶DNA序列，從而達(dá)到基因敲除的目的[34]（圖1b）。構(gòu)建能特異性識(shí)別靶DNA的ZFP結(jié)構(gòu)域是ZFN技術(shù)的關(guān)鍵。因此，只需根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)出鋅指結(jié)構(gòu)域，再與FokⅠ融合形成ZFNs。然后將融合的ZFNs通^電穿孔、轉(zhuǎn)染及病毒運(yùn)輸?shù)确绞綄?dǎo)入細(xì)胞核中完成對(duì)靶基因敲除。

3.2 ZFN技術(shù)的應(yīng)用

ZFN作為一種靶向修飾技術(shù)，可以精確地修飾基因及其周圍調(diào)控元件，在生物體基因組改造與基因功能研究等方面得到廣泛應(yīng)用。ZFN已經(jīng)成功應(yīng)用于線蟲(chóng)、大鼠、小鼠、中國(guó)倉(cāng)鼠、果蠅、海膽、斑馬魚(yú)、家蠶、植物、豬及人類iPS細(xì)胞和ES細(xì)胞中[35]。主要包括以下兩方面：①對(duì)動(dòng)植物基因組的靶向修飾。Bibikova等[29]利用ZFN技術(shù)對(duì)果蠅X性染色體的yellow基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，結(jié)果發(fā)現(xiàn)50%的雄性果蠅發(fā)生顏色的改變。Zhang等[36]設(shè)計(jì)了針對(duì)敲除擬南芥ADH1和TT4基因的ZFN，通過(guò)雌激素誘導(dǎo)啟動(dòng)子表達(dá)，研究發(fā)現(xiàn)T1代分別有7%和16%的植物含有體細(xì)胞突變，并且能穩(wěn)定遺傳給后代。②疾病的治療。Li等[37]利用ZFN技術(shù)治愈了血友病B型小鼠，這為以后利用ZFN技術(shù)治療基因疾病提供了新的有效手段。

3.3 ZFN技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

ZFN作為第一代人工核酸內(nèi)切酶技術(shù)，打破了只能通過(guò)同源重組的方式對(duì)基因組進(jìn)行改造的觀念。ZFN技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)包括：①與傳統(tǒng)的方法相比較，ZFN技術(shù)提高了基因組的編輯效率，操作簡(jiǎn)單，可以快速敲除目的基因。②能夠廣泛地應(yīng)用于各種生物，并誘導(dǎo)靶位點(diǎn)進(jìn)行定點(diǎn)突變。

ZFN技術(shù)也存在著許多的局限性：①存在脫靶現(xiàn)象。由于ZFN對(duì)靶位點(diǎn)進(jìn)行切割時(shí)容易脫靶，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，從而對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒副作用。②存在上下文依賴效應(yīng)[38]。ZFN在識(shí)別靶DNA位點(diǎn)時(shí)，識(shí)別靶DNA的重復(fù)氨基酸之間會(huì)相互作用，導(dǎo)致識(shí)別的特異性發(fā)生改變，即識(shí)別靶DNA的特異性不高，影響基因打靶的效果。③成本高。由于ZFN的特異性不高，很難設(shè)計(jì)出高特異性的鋅指組合，目前該技術(shù)一直被生物公司壟斷。

4 轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）技術(shù)

1989年一類可以使植物患病的轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)蛋白TALE（Transcription activator-like effector）在黃單胞桿菌（Xanthomonas）中分離得到[39]。2007年Kay等[40]發(fā)現(xiàn)一種TALE蛋白（AvrBs3）可以被黃單胞桿菌注入到宿主細(xì)胞內(nèi)，然后進(jìn)入宿主細(xì)胞核，與宿主upa20基因的啟動(dòng)子結(jié)合，激活宿主upa20基因的表達(dá)。2009年Moscou等[41]發(fā)現(xiàn)了TALE蛋白特異結(jié)合宿主基因啟動(dòng)子的機(jī)制。隨著對(duì)TALE蛋白的深入了解，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)TALE蛋白可以補(bǔ)足第一代人工合成的核酸內(nèi)切酶（ZFN）技術(shù)的許多缺陷。2010年Christian等[42]首次報(bào)道了人工構(gòu)建的TALEN技術(shù)。2011年Li等[43]用AvrXa7和PthXo1中天然存在的TALE重復(fù)序列進(jìn)行了類似的試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)FokⅠ結(jié)構(gòu)域連接到TALE結(jié)構(gòu)域的C端的切割效果好于連接到N端。2012年Deng等[44]通過(guò)解析TALE蛋白的晶體結(jié)構(gòu)，清晰揭示了TALE蛋白結(jié)合DNA的作用機(jī)制，為以后更好改造和應(yīng)用TALEN打下了基礎(chǔ)。

4.1 TALEN的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

TALEN是由TALE結(jié)構(gòu)域和核酸內(nèi)切酶（FokⅠ）的切割結(jié)構(gòu)域兩部分組成[45]。與ZFN技術(shù)原理類似，TALE結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)識(shí)別并特異結(jié)合靶DNA序列，F(xiàn)okⅠ的切割結(jié)構(gòu)域主要負(fù)責(zé)切割靶DNA。

TALE蛋白是由N端的具有分泌信號(hào)功能的易位結(jié)構(gòu)域（Translocation domain，TD）、中部DNA特異識(shí)別結(jié)合域、C端核定位信號(hào)（Nuclear localization signal，NLS）和轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（Activation domain，AD）4部分構(gòu)成。其中，中部DNA特異識(shí)別結(jié)合域是由一系列數(shù)目不定的串聯(lián)重復(fù)單元組成。每個(gè)重復(fù)單元通常由34個(gè)氨基酸組成[46]，其中32個(gè)氨基酸是高度保守的，只有12位和13位上的氨基酸是可變化的，這2個(gè)氨基酸又被稱為重復(fù)可變雙殘基（Repeat variable diresidue，RVD）。每個(gè)重復(fù)單元只識(shí)別1個(gè)核苷酸，其識(shí)別的特異性由RVD決定，并且RVD可與4種堿基有特定的配對(duì)關(guān)系，即NI特異識(shí)別A，HD特異識(shí)別C，NG特異識(shí)別T，NH特異識(shí)別G，NN對(duì)應(yīng)G或A[41，46]。研究發(fā)現(xiàn)，第12位氨基酸主要起穩(wěn)定RVD環(huán)的功能，第13位氨基酸是真正識(shí)別特異堿基的氨基酸，決定識(shí)別的特異性[44，47]（圖2a）。

FokⅠ與TALE的C端融合形成TALEN。對(duì)靶DNA進(jìn)行切割時(shí)，F(xiàn)okⅠ也需要形成二聚體發(fā)揮切割作用，當(dāng)兩個(gè)TALEN分別結(jié)合到各自的靶DNA序列上時(shí)，2個(gè)FokⅠ會(huì)在靶DNA序列的間隔區(qū)（Spacer，14～18 bp）處形成二聚體[48]，并對(duì)靶DNA進(jìn)行切割，形成DSB切口，進(jìn)而引發(fā)細(xì)胞內(nèi)的NHEJ和HR修復(fù)機(jī)制，導(dǎo)致基因沉默（圖2b）。總之，通過(guò)構(gòu)建不同的TALE就可實(shí)現(xiàn)對(duì)不同靶DNA的切割。

4.2 TALEN技術(shù)的應(yīng)用

TALEN技術(shù)的發(fā)明使得基因組編輯效率明顯提高，因此，在人、小鼠、大鼠、斑馬魚(yú)、水稻、擬南芥等物種中得到廣泛應(yīng)用。①遺傳病治療方面的應(yīng)用。科研人員利用TALEN技術(shù)對(duì)來(lái)源β-地中海貧血病人的非整合型iPSCs進(jìn)行珠蛋白基因HBB修復(fù)，研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞在修復(fù)過(guò)程中沒(méi)有產(chǎn)生TALEN引發(fā)的脫靶突變并且這些修復(fù)好的iPSCs具有多能性及正常核型，表明這種方法可作為一種治療地中海貧血疾病的有效途徑[50]。②生物模型的構(gòu)建。2014年中國(guó)科學(xué)家利用TALEN技術(shù)成功的敲除了食蟹猴基因。首次用該技術(shù)成功構(gòu)建了非人類靈長(zhǎng)類動(dòng)物模型[51]。③新品種的培育。Li等[52]利用TALEN技術(shù)剔除掉了水稻基因組中對(duì)水稻白葉枯病敏感基因Os11N3，獲得了穩(wěn)定遺傳的抗病水稻新品種。這也顯示出了TALEN技術(shù)介導(dǎo)的基因定點(diǎn)修飾在作物遺傳育種中具有廣闊的應(yīng)用前景。

4.3 TALEN技術(shù)的優(yōu)缺點(diǎn)

作為第二代人工合成的核酸內(nèi)切酶技術(shù)，與ZFN技術(shù)相比，TALEN技術(shù)具有明顯的優(yōu)勢(shì)。①與ZFN技術(shù)相比，TALEN篩選更為簡(jiǎn)便，它不需要復(fù)雜的篩選過(guò)程，只需要簡(jiǎn)單的分子克隆技術(shù)就可以獲得高效的TALEN。②脫靶現(xiàn)象減少，降低了對(duì)細(xì)胞的毒性。③切割位點(diǎn)的特異性強(qiáng)。

TALEN技術(shù)雖然有很多優(yōu)點(diǎn)，但也存在許多不足。主要包括：①TALE蛋白較大，并且序列重復(fù)性很強(qiáng)，構(gòu)建表達(dá)載體較為復(fù)雜[53]。一般由生物公司合成，r格較貴。②仍然存在脫靶現(xiàn)象。③一對(duì)TALEN只能對(duì)一個(gè)靶基因進(jìn)行修飾。當(dāng)對(duì)多個(gè)基因同時(shí)進(jìn)行編輯時(shí)，需要共轉(zhuǎn)染多個(gè)TALEN載體，這樣會(huì)導(dǎo)致轉(zhuǎn)染效率下降，很難獲得所需的陽(yáng)性細(xì)胞[54]。

5 CRISPR-Cas核酸酶（CRISPR-Cas RGNs）技術(shù)

1987年Ishino等[55]首先在大腸桿菌的堿性磷酸酶基因下游發(fā)現(xiàn)了成簇的短間隔重復(fù)序列，但該序列當(dāng)時(shí)沒(méi)有引起人們的足夠重視。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)大約40%的細(xì)菌和90%的古生菌都存在這種成簇的短間隔重復(fù)序列。2002年這種成簇的短間隔重復(fù)序列被命名為串聯(lián)間隔短回文重復(fù)序列[56，57]（Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR）。此外，在CRISPR位點(diǎn)附近還存在著多個(gè)與CRISPR相關(guān)的Cas（CRISPR-associated genes）基因。隨后的研究又發(fā)現(xiàn)，CRISPR中的間隔序列與質(zhì)粒或噬菌體等外源DNA序列高度同源。當(dāng)病毒入侵宿主細(xì)胞時(shí)，細(xì)菌和古細(xì)菌中的CRISPR序列就能夠引導(dǎo)CRISPR相關(guān)（CRISPR-associated，Cas）蛋白使外源DNA降解，從而起到免疫保護(hù)的作用[58]。

5.1 CRISPR-Cas系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)及作用機(jī)理

CRISPR-Cas系統(tǒng)主要是由CRISPR序列元件和Cas基因家族蛋白組成[59]。目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)一般被分為3種類型：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型。Ⅰ型和Ⅲ型系統(tǒng)在介導(dǎo)靶DNA雙鏈降解時(shí)需要多種Cas蛋白的參與，而Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)只需要Cas9就可完成對(duì)靶DNA雙鏈的切割[60]。通過(guò)比較，Ⅱ型CRISPR-Cas系統(tǒng)更為簡(jiǎn)便，更適合應(yīng)用于基因編輯。目前，CRISPR-Cas技術(shù)主要是Cas9系統(tǒng)的應(yīng)用，本研究將對(duì)CRISPR-Cas9系統(tǒng)進(jìn)行闡述。

CRISPR序列元件主要是由一個(gè)前導(dǎo)序列（Leader）、多個(gè)重復(fù)序列（Repeats）及多個(gè)間隔序列（Spacers）組成，其中重復(fù)序列和間隔序列以相互交替的方式連接（圖3）。前導(dǎo)序列是一段富含AT，長(zhǎng)度為550 bp的不保守序列，位于CRISPR的上游，可啟動(dòng)CRISPR序列轉(zhuǎn)錄；重復(fù)序列是一組長(zhǎng)度為23～50 bp，平均長(zhǎng)度為31 bp的高度保守的短小序列；間隔序列為來(lái)源于噬菌體、質(zhì)粒等的平均長(zhǎng)度為36 bp的外源基因片段即原間隔序列（Protospacers）[61]。Cas9是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域蛋白，主要由α-螺旋組成的識(shí)別區(qū)（REC）、位于蛋白中間位置的HNH核酸酶結(jié)構(gòu)域、 位于氨基末端的RuvC-like結(jié)構(gòu)域以及位于C端的PAM結(jié)合區(qū)組成[62]。

CRISPR-Cas9系統(tǒng)[63]的作用機(jī)理可分為3個(gè)階段：①可變間隔序列的獲得[64]。CRISPR-Cas9系統(tǒng)能夠識(shí)別外源核酸中的特殊片段，該特殊片段中存在原型間隔序列毗鄰基序（Protospacer-associated motif，PAM），并將PAM旁的原型間隔序列加工整合入自身基因組中的CRISPR序列中。②crRNA（CRISPR-derived RNA）的形成[60]。在前導(dǎo)序列的啟動(dòng)下CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生前體CRISPR RNA（pre-CRISPR RNA，pre-crRNA），隨后CRISPR轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的tracrRNA（trans- activating crRNA）與pre-crRNA形成RNA異二聚體，在Cas蛋白的作用下，pre-crRNA被加工成crRNA。③對(duì)外源DNA的切割[64]。成熟的crRNA、tracrRNA及Cas9結(jié)合形成一個(gè)三元的沉默復(fù)合物。而后在crRNA的引導(dǎo)下由Cas9蛋白對(duì)目的基因進(jìn)行切割。在切割時(shí)Cas9蛋白的HNH能夠特異性識(shí)別與crRNA互補(bǔ)配對(duì)的模板鏈并對(duì)其切割，切割位點(diǎn)位于PAM上游3 nt處；RuvC-1ike參與另一條鏈特定位點(diǎn)的切割，切割位點(diǎn)位于PAM上游3～8 nt處（NGG位點(diǎn)）[65]。Cas9蛋白對(duì)外源DNA進(jìn)行切割后也會(huì)產(chǎn)生DSB切口，并通過(guò)NHEJ和HR的方式進(jìn)行修復(fù)[66]（圖4）。因此，通過(guò)設(shè)計(jì)不同的crRNA可以使CRISPR-Cas9剪切不同的DNA序列。Jinek等[67]將成熟的crRNA和tracrRNA這兩種RNA構(gòu)建成一個(gè)向?qū)NA（single-guide RNA，sgRNA）與Cas9融合，發(fā)現(xiàn)由sgRNA和Cas9蛋白構(gòu)成的新CRISPR-Cas系統(tǒng)仍可對(duì)目的基因進(jìn)行切割。所以，可將CRISPR-Cas9系統(tǒng)簡(jiǎn)化成Cas9蛋白與sgRNA。

5.2 CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用

目前，CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用仍處在初級(jí)階段，但在基因功能的研究、模式生物的構(gòu)建、遺傳育種等方面得到廣泛應(yīng)用。①在基因功能研究中的應(yīng)用。與傳統(tǒng)的基因敲除技術(shù)相比，CRISPR-Cas系統(tǒng)能夠?qū)Χ喾N細(xì)胞及生物體的目的基因進(jìn)行高效快速的敲除，是研究基因功能的重要工具。Shalem等[68]構(gòu)建了一個(gè)含有65 000種sgRNA的文庫(kù)，這些sgRNA可以靶向人類基因組中18 080種基因，幾乎涵蓋了每個(gè)已知的基因。并將編碼這些sgRNA的基因和編碼Cas9蛋白的基因一起轉(zhuǎn)運(yùn)到人類細(xì)胞中，從而篩選出具有特定功能的基因。②動(dòng)物模型的構(gòu)建。2013年Wang等[69]在小鼠的胚胎干細(xì)胞中使用CRISPR-Cas9系統(tǒng)，對(duì)Tet1、Tet2、Tet3、Sry和Uty-8這5個(gè)基因進(jìn)行同時(shí)編輯，產(chǎn)生了基因敲除新個(gè)體。這為研究基因家族成員的功能相關(guān)性提供新方法。③新品種的改良與培育方面的應(yīng)用。Shan等[70]利用CRISPR-Cas9技術(shù)去掉了一個(gè)小麥基因，得到了耐白粉病的小麥新品種。還利用CRISPR-Cas9技術(shù)定點(diǎn)突變了水稻和小麥兩種作物的OsPDS和TaMLO基因，發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體中基因突變效率為14.5%～38.0%，水稻轉(zhuǎn)基因植物中突變效率4.0%～9.4%，并且在T0代獲得了水稻純合PDS突變體，呈現(xiàn)預(yù)期的白化和矮小表型。

5.3 CRISPR-Cas系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)

作為第三代人工合成的核酸酶，與ZFN技術(shù)和TALEN技術(shù)相比具有明顯的優(yōu)勢(shì)。主要表現(xiàn)在：①CRISPR-Cas系統(tǒng)的切割能力更強(qiáng)。CRISPR-Cas系統(tǒng)可以切割一些ZFN和TALEN不能接近的位點(diǎn)[71]。②操作更為簡(jiǎn)便，試驗(yàn)周期更短，成本更低。突變不同的靶位點(diǎn)只需設(shè)計(jì)與靶位點(diǎn)互補(bǔ)的sgRNA，然后將sgRNA克隆到表達(dá)質(zhì)粒上即可。③CRISPR-Cas系統(tǒng)可以同時(shí)對(duì)多個(gè)靶基因進(jìn)行定點(diǎn)修飾，因此大大提高了修飾效率。

CRISPR-Cas系統(tǒng)的應(yīng)用仍處于初級(jí)階段，存在許多不足：①5′-GN19NGG-3′的結(jié)構(gòu)有時(shí)會(huì)出現(xiàn)限制性，會(huì)對(duì)靶位點(diǎn)以外的序列進(jìn)行編輯，產(chǎn)生多余的DNA突變[72]。②CRISPR-Cas系統(tǒng)識(shí)別靶序列的長(zhǎng)度較短，不能根據(jù)需求進(jìn)行調(diào)節(jié)。③仍存在脫靶現(xiàn)象。

6 展望

基因功能缺失技術(shù)已經(jīng)在生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用，成為了研究基因的主要方法。隨著基因功能缺失技術(shù)的不斷更新，已從反義RNA技術(shù)發(fā)展到了CRISPR-Cas技術(shù)，并且其應(yīng)用范圍越來(lái)越廣泛，對(duì)目的基因的編輯效率越來(lái)越高，操作越來(lái)越簡(jiǎn)便。目前基因功能缺失技g仍存在許多不足，限制了其發(fā)展。隨著研究的不斷深入與發(fā)展，基因功能缺失技術(shù)必將得到不斷改進(jìn)和完善，也一定會(huì)對(duì)基因功能方面的研究做出更大的貢獻(xiàn)。

參考文獻(xiàn)：

[1] SIMONS R W. Naturally occurring antisense RNA control-a brief review[J].Gene，1988，72（1-2）：35-44.

[2] 宮 明，宮 鋒.反義RNA調(diào)控的不同方式[J].生命的化學(xué)（中國(guó)生物化學(xué)會(huì)訊），1996，16（4）：17-18.

[3] TU H Y，LIU Y F. The mechanism of antisense RNA and its application in the plant gene engineering[J].Biomagnetism，2005，5（2）：32-34.

[4] OELLER P W，LU M W，TAYLOR L P，et al.Reversible inhibition of tomato fruit senescence by antisense RNA[J].Science，1991，254（5030）：437-439.

[5] NELSON A，ROTH D A，JOHNSON J D.Tobacco mosaic virus infection of transgenic Nicotiana tabacum plants is inhibited by antisense constructs directed at the 5′ region of viral RNA[J]. Gene，1993，127（2）：227-232.

[6] YOUNG K，JAYASURIYA H，ONDEYKA J G，et al.Discovery of FabH/FabF inhibitors from natural products[J]. Antimicrob Agents Chemother，2006，50（2）：519-526.

[7] 丁月月，李 霜，黃 和.反義RNA技術(shù)在絲狀真菌代謝工程中的應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào)，2009，25（9）：1316-1320.

[8] 莫 凡，王傳之，朱永智，等.反義RNA在水稻遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（4）：8-9.

[9] 張西鋒，沈 偉，潘慶杰，等.反義RNA技術(shù)原理及其在疾病治療中的應(yīng)用[J].萊陽(yáng)農(nóng)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，21（1）：20-22，33.

[10] FIRE A，XU S，MONTGOMERY M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdit is elegans[J]. Nature，1998，391（6669）：806-811.

[11] NAPOLI C，LEMIEUX C，JORGENSEN R. Introduction of a chimeric chalcone synthase gene into petunia results in reversible co-suppression of homologous genes in trans.[J]. Plant Cell，1990，2（4）：279-289.

[12] COGONI C，ROMANO N，MACINO G.Suppression of gene expression by homologous transgenes[J]. Antonie Van Leeuwenhoek，1994，65（3）：205-209.

[13] GUO S，KEMPHUES K J. Par-1， a gene required for establishing polarity in C. elegans embryos， encodes a putative Ser/Thr kinase that is asymmetrically distributed[J].Cell，1995，81（4）：611-620.

[14] BERNSTEIN E，CAUDY A A，HAMMOND S M，et al.Role for a bidentate ribonuclease in the initiation step of RNA interference[J].Nature，2001，409（6818）：363-366.

[15] SONTHEIMER E J. Assembly and function of RNA silencing complexes[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2005，6（2）：127-138.

[16] ZAMORE P D. RNA interference： Listening to the sound of silence[J]. Nat Struct Biol，2001，8（9）：746-750.

[17] DOGINI D B，AVANSINI S H，VIEIRA A S，et al.The new world of RNAs[J].Genet Mol Biol，2014，37（1）：285-293.

[18] AN Y，CAI Y，GUAN Y，et al. Inhibitory effect of small interfering RNA targeting insulin-like growth factor-I receptor in ovarian cancer OVCAR3 cells[J].Cancer Biother Radiopharm，2010，25（5）：545-552.

[19] 毛穎波，薛學(xué)義，陳曉亞.植物小RNAcRNA干擾：生物學(xué)功能與應(yīng)用前景[J].中國(guó)科學(xué)（生命科學(xué)），2009，39（1）：31-43.

[20] YU D M，HAO L J，WANG D Y，et al. Influence of RNA interference mediated cyclinD1 gene silencing on the proliferation and G1 phase regulators of fibroblasts derived from keloid[J]. Prog Biochem Bio-phys，2008，35（2）：159-169.

[21] 袁成良，金曉嵐.RNA干擾原理及應(yīng)用研究進(jìn)展[J].西部醫(yī)學(xué)，2009（4）：664-666.

[22] JIN P，ZARNESCU D S，CEMAN S，et al. Biochemical and genetic interaction between the fragile X mental retardation protein and the microRNA pathway[J].Nat Neurosci，2004，7（2）：113-117.

[23] MAKIMURA H，MIZUNO T M，MASTAITIS J W，et al. Reducing hypothalamic AGRP by RNA interference increases metabolic rate and decreases body weight without influencing food intake[J]. BMC Neurosci，2002（3）：18.

[24] DUFF C J，HOOPPER N M.PCSK9：An emerging target for treatment of hypercholesterolemia[J]. Expert Opin Ther Targets，2011，15（2）：157-168.

[25] MCMANUS M T，SHARP P A. Gene silencing in mammals by small interfering RNAs[J]. Nat Rev Genet，2002，3（10）：737-747.

[26] 張巧麗，黃金昶.RNAi技術(shù)及其在腫瘤學(xué)應(yīng)用方面的研究進(jìn)展[J].中國(guó)臨床醫(yī)生雜志，2015，43（1）：14-17.

[27] KIM Y G，CHA J，CHANDRASEGARAN S. Hybrid restriction enzymes： Zinc finger fusions to Fok I cleavage domain[J].Proc Natl Acad Sci U S A，1996，93（3）：1156-1160.

[28] BIBIKOVA M，CARROLL D，SEGAL D J，et al. Stimulation of homologous recombination through targeted cleavage by chimeric nucleases[J].Mol Cell Biol，2001，21（1）：289-297.

[29] BIBIKOVA M，GOLIC M，GOLIC K G，et al. Targeted chromosomal cleavage and mutagenesis in Drosophila using zinc-finger nucleases[J].Genetics，2002，161（3）：1169-1175.

[30] WOLFE S A，NEKLUDOVA L，PABO C O. DNA recognition by Cys2His2 zinc finger proteins[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct，2000，29：183-212.

[31] PABO C O，PEISACH E，GRANT R A. Design and selection of novel Cys2His2 zinc finger proteins[J].Annu Rev Biochem，2001，70：313-340.

[32] HAUSCHILD Q J，PETERSEN B，COST G J，et al. Gene knockout and knockin by zinc-finger nucleases： Current status and perspectives[J]. Cell Mol Life Sci，2013，70（16）：2969-2983.

[33] PALPANT N J，DUDZINSKI D. Zinc-finger nucleases：Looking toward translation[J].Gene Ther，2013，20（2）：121-127.

[34] 白雪，孫其信，李海峰.基因修飾技術(shù)研究進(jìn)展[J].生物工程學(xué)報(bào)，2015，31（8）：1162-1174.

[35] URNOV F D，REBAR E J，HOLMES M C，et al. Genome editing with engineered zinc finger nucleases[J]. Nat Rev Genet，2010，11（9）：636-646.

[36] ZHANG F，MAEDER M L，UNGER W E，et al.High frequency targeted mutagenesis in Arabidopsis thaliana using zinc finger nucleases[J].Proc Natl Acad Sci USA，2010，107（26）：12028-12033.

[37] LI H，HAURIGOT V，DOYON Y，et al. In vivo genome editing restores hemostasis in a mouse model of haemophilia[J].Nature，2011，475（7355）：217-221.

[38] SANDER J D，DAHLBORG E J，GOODWIN M J，et al. Selection-free zinc-finger-nuclease engineering by context-dependent assembly（CoDA）[J].Nat Methods，2011，8（1）：67-69.

[39] BONAS U，STALL R E，STASKAWICZ B. Genetic and structural characterization of the avirulence gene avrBs3 from Xanthomonas campestris pv. vesicatoria[J].Mol Gen Genet，1989， 218（1）：127-136.

[40] KAY S，HAHN S，MAROIS E，et al. A bacterial effector acts as a plant transcription factor and induces a cell size regulator[J].Science，2007，318（5850）：648-651.

[41] MOSCOU M J，BOGDANOVE A J. A simple cipher governs DNA recognition by TAL effectors[J].Science，2009，326（5959）：1501.

[42] CHRISTIAN M，CERMAK T，DOYLE E L，et al.Targeting DNA double-strand breaks with TAL effector nucleases[J].Genetics，2010，186（2）：757-761.

[43] LI T，HUANG S，JIANG W Z，et al. TAL nucleases （TALNs）：Hybrid proteins composed of TAL effectors and FokI DNA-cleavage domain[J].Nucleic Acids Research，2011，39（1）：359-372.

[44] DENG D，YAN C，PAN X，et al.Structural basis for sequence-specific recognition of DNA by TAL effectors[J].Science，2012，335（6069）：720-723.

[45] 周 維，付喜愛(ài)，張德顯，等.基因敲除技術(shù)的研究進(jìn)展[J].中國(guó)獸醫(yī)雜志，2015，51（3）：67-69.

[46] BOCH J，SCHOLZE H，SEBASTIAN S，et al.Breaking the code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors[J].Science，2009，326（5959）：1509-1512.

[47] MAK A N，BRADLEY P，CERNADAS R A，et al. The crystal structure of TAL effector PthXo1 bound to its DNA target[J]. Science，2012，335（6069）：716-719.

[48] MILLER J C，TAN S，QIAO G，et al. A TALE nuclease architecture for efficient genome editing[J]. Nat Biotechnol，2011， 29（2）：143-148.

[49] JOUNG J K，SANDER J D. TALENs： A widely applicable technology for targeted genome editing[J]. Nat Rev Mol Cell Biol，2012，14（1）：49-55.

[50] MA N，LIAO B，ZHANG H，et al. TALEN-mediated gene correction in integration-free β-thalassemia iPSCs[J]. J Biol Chem，2013，288（48）：34671-34679.

[51] LIU H，CHEN Y，NIU Y，et al. TALEN-mediated gene mutagenesis in rhesus and cynomolgus monkeys[J].Cell Stem Cell，2014，14（3）：323C328.

[52] LI T，LIU B，SPALDING M H，et al. High-efficiency TALEN-based gene editing produces disease-resistant rice[J].Nat Biotechnol，2012，30（5）：390-392.

[53] 紋埃高彩霞.植物基因組編輯及衍生技術(shù)最新研究進(jìn)展[J].遺傳，2015，37（10）：953-973.

[54] 李 東，左其生，張亞妮，等.基因組編輯技術(shù)的研究進(jìn)展[J].畜牧與獸醫(yī)，2015（7）：124-129.

[55] ISHINO Y，SHINAGAWA H，MAKINO K，et al. Nucleotide sequence of the iap gene， responsible for alkaline phosphatase isozyme conversion in Escherichia coli， and identification of the gene product[J].J Bacteriol，1987，169（12）：5429-5433.

[56] MOJICA F J M，D？EZ-VILLASE？mOR C，SORIA E，et al. Biological significance of a family of regularly spaced repeats in the genomes of Archaea，Bacteria and mitochondria[J].Mol Microbiol，2000，36（1）：244-246.

[57] JANSEN R，EMBDEN J D，GAASTRA W，et al.Identification of genes that are associated with DNA repeats in prokaryotes[J].Mol Microbiol，2002，43（6）：1565-1575.

[58] 黃 蕾，王雅潔，陳 實(shí).非編碼RNA編輯技術(shù)研究進(jìn)展[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2015，37（7）：1036-1045.

[59] w 欣，胡 軍.CRISPR/Cas基因編輯系統(tǒng)及其在植物中的研究進(jìn)展[J].中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào)，2015，31（12）：187-192.

[60] DELTCHEVA E，CHYLINSKI K，SHARMA C M，et al.CRISPR RNA maturation by trans-encoded small RNA and host factor RNase III[J].Nature，2011，471（7340）：602-607.

[61] MARRAFFINI L A，SONTHEIMER E J.CRISPR interference： RNA-directed adaptive immunity in bacteria and archaea[J].Nat Rev Genet，2010，11（3）：181-190.

[62] NISHIMASU H，RAN F A，HSU P，et al. Crystal structure of Cas9 in complex with guide RNA and target DNA[J].Cell，2014，156（5）：935-949.

[63] 倪培凌，劉 暢，陳凌懿.DNA剪刀――TALEN和CRISPR/Cas[J].中國(guó)細(xì)胞生物學(xué)學(xué)報(bào)，2014，36（1）：5-11.

[64] 劉思也，夏海濱.一種新的由CRISPR/Cas系統(tǒng)介導(dǎo)的基因組靶向修飾技術(shù)[J].中國(guó)生物工程雜志，2013，33（10）：117-123.

[65] FRIEDLAND A E，TZUR Y B，ESVELT K M，et al.Heritable genome editing in C. elegans via a CRISPR-Cas9 system[J]. Nat Methods，2013，10（8）：741-743.

[66] WIEDENHEFT B，STERNBERG S H，DOUDNA J A. RNA-guided genetic silencing systems in bacteria and archaea[J].Nature，2012，482（7385）：331-338.

[67] JINEK M，CHYLINSKI K，F(xiàn)ONFARA I，et al.A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity[J].Science，2012，337（6096）：816-821.

[68] SHALEM O，SANJANA N E，HARTENIAN E，et al. Genome-scale CRISPR-Cas9 knockout screening in human cells[J].Science，2014，343（6166）：84-87.

[69] WANG H，YANG H，SHIVALILA C S，et al.One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering[J].Cell，2013，153（4）：910-918.

[70] SHAN Q，WANG Y，LI J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J].Nat Biotechnol，2013，31（8）：686-688.