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遺傳學(xué)重疊效應(yīng)范文1

關(guān)鍵詞：油菜；三隱性核全不育系；臨保系；優(yōu)勢

中圖分類號 S565.4 文獻(xiàn)標(biāo)識碼 A 文章編號 1007-7731（2017）05-0066-03

國內(nèi)報(bào)道的油菜細(xì)胞核不育類型主要有雙基因隱性核不育[1-3]，該不育系應(yīng)用的一個最大障礙就是制種時要在其開花期拔除50%的可育株，不但影響制種產(chǎn)量和種子純度，還增加了制種成本。如何解決這一問題已成為多年來油菜育種界研究的熱點(diǎn)。

陳鳳祥等[7]報(bào)道了甘藍(lán)型油菜隱性核不育系9012A的不育性受2對隱性重疊基因和1對隱性上位抑制基因互作控制[5]，并找到了能100%保持其不育性的臨時保持系[6]，初步實(shí)行“三系”配套，克服了傳統(tǒng)“二系法”制種時需拔除50%可育株的難題，為隱性核不育雜種優(yōu)勢利用開辟了一條新途徑。陳鳳祥等[7]提出的隱性上位互作遺傳假說，可以從存在隱性互作的雜交組合后代群體中分離出純合三隱性完全保持系。這種保持系自交后代不分離，與純合不育株測交后代植株100%表現(xiàn)不育，但與全不育系回交后代則只出現(xiàn)50%不育株，把這種保持系稱作臨保系（TAM）。根據(jù)遺傳分離規(guī)律，在存隱性互作的雜交組合F2代中可育株和不育株的分離比例有3∶1，15∶1，13∶3和61∶3等情況，在13∶3和61∶3分離的小區(qū)中可育株套袋自交并且分別與不育株一對一測交，可從中找到臨時保持系；在3∶1和15∶1分離的小區(qū)中進(jìn)行兄妹交，能找到純合兩型系，從而完成三系配套。

1 材料與方法

1.1 材料 2004年漢中農(nóng)科所引進(jìn)三隱性細(xì)胞核不育三系雜交種向農(nóng)03（上海市農(nóng)科院周熙榮先生惠贈）作為分離對象。

1.2 方法 2005年春季在F1群體中選擇200個優(yōu)良單株套袋自交，收獲后進(jìn)行品質(zhì)分析。2006年春季在F2代株系中調(diào)查育性分離情況，篩選出4個育性分離為13∶3的株系，在這4個株系中選擇可育株大量套袋自交，并且與株系中的不育株成對測交。

2 結(jié)果與分析

2.1 選育純合兩型系13AB 圖1顯示：2007年觀察了165份可育株自交后代及其成對測交（兄妹交）組合的育性表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)2個全不育組合，對應(yīng)父本自交不分離。據(jù)此鑒定并分離出了2個臨時保持系，記為TAM-1、TAM-2。在組合分離中同時發(fā)現(xiàn)了5個育性分離比例1∶1的株系，對應(yīng)父本自交育性分離比例3∶1，由于在1∶1系中不能確定其純合或雜合，因此，繼續(xù)在1∶1的組合內(nèi)選不育株與可育株成對兄妹交，相應(yīng)可育株套袋自交，不育株同時與臨時保持系測交；在2個臨時保持系中繼續(xù)套袋自交。2008年春，結(jié)合上年兄妹交與測交組合以及相應(yīng)可育株自交的鑒定結(jié)果，篩選出2個兄妹交育性分離1∶1，與臨保系測交全不育，可育株自交分離3∶1的組合即純合兩型系，隨后繼續(xù)在組合內(nèi)兄妹交―自交―兄妹交，嚴(yán)格進(jìn)行品質(zhì)改良，穩(wěn)定純合兩用系的雙低品質(zhì)。至2010年育成穩(wěn)定純合兩型系13AB。

2.2 臨時保持系4081-1的選育 圖2顯示：與純合兩型系13AB配套的臨時保持系4081-1的選育，觀察了165份可育株自交后代及其成對測交（兄妹交）組合的育性表現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)2個全不育組合，對應(yīng)父本自交不分離。據(jù)此鑒定并分離出了2個臨時保持系。以純合兩型系中的不育株與配套臨時保持系雜交得到全不育系SY13A。之后擴(kuò)大群體對其品質(zhì)和農(nóng)藝性狀進(jìn)行連續(xù)4代選擇，使雙低品質(zhì)和農(nóng)藝性狀達(dá)到穩(wěn)定一致。

2.3 隱型上位基因互作核不育三系繁殖、制種模式 圖3顯示：甘藍(lán)型半冬性上位互作細(xì)胞核全不育系油菜SY13A的不育性受2對重疊基因和1對上位基因共同抑制。當(dāng)2對基因?yàn)殡[性純合體（m1m1m2m2），另1對互作基因?yàn)轱@性純合體（RR）和雜合體（Rr）時，植株表現(xiàn)不育（m1m1m2m2RR或m1m1m2m2Rr），其不育純合體相應(yīng)的臨保系基因型為3對隱性純合體（m1m1m2m2rr）。利用純合兩型系中的不育株（m1m1m2m2RR）和可育株（M1m1m2m2RR或m1m1M2m2RR）成對兄妹交可產(chǎn)生純合兩型系（M1m1m2m2RR或m1m1M2m2RR）和純合不育系（m1m1m2m2RR），利用純合兩型系中的不育系（m1m1m2m2RR）和臨保系（m1m1m2m2rr）雜交可獲得全不育系（m1m1m2m2Rr），全不育系與恢復(fù)系（M1M1_ _或M2M2_ _）雜交可獲得全可育雜交種，從而將隱型核不育系SY13A的三系雜交種應(yīng)用于生產(chǎn)。

3 討論

甘藍(lán)型油菜隱性上位互作核不育系具有恢復(fù)源廣，配組自由，易于選配強(qiáng)優(yōu)勢組合，易于轉(zhuǎn)育，育性穩(wěn)定，可避免不育胞質(zhì)可能存在的負(fù)效應(yīng)和細(xì)胞質(zhì)單一化的潛在危險等優(yōu)點(diǎn)[8]，更為重要的是解決了隱性核不育兩型系制種時拔除不育系中50%可育株的難題，提高了制種產(chǎn)量，降低了制種成本，保證了制種純度，在雜交油菜育種方面具有顯著的優(yōu)越性。此外，還有學(xué)者做了相關(guān)研究，如陳大倫等[9]對甘藍(lán)型油菜隱性上位細(xì)胞核雄性不育純合兩型系、臨保系和全不育系的轉(zhuǎn)育方法進(jìn)行了介紹.其要點(diǎn)是先轉(zhuǎn)育隱性上位細(xì)胞核雄性不育純合兩型系，然后再通過回交轉(zhuǎn)育主要農(nóng)藝性狀與純合兩型系相近或完全一致的相應(yīng)的全不育臨保系；陳芝能等[10]甘藍(lán)型油菜雙隱性基因細(xì)胞核+廣恢型細(xì)胞質(zhì)雄性不育（RRGCMS）三系綜合了RM 5637A細(xì)胞質(zhì)雄性不育和雙隱性基因細(xì)胞核不育的優(yōu)點(diǎn)；董發(fā)明等[11]通過對甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核雄性不育系9012AB及其臨保系T45與來源不同的幾個自交系和常規(guī)品種雜交和測交后代的遺傳分析，提出了隱性細(xì)胞核雄性不育系9012AB的新遺傳模式；李婧婧等提出[12]9012AB是甘藍(lán)型油菜隱性上位細(xì)胞核雄性不育兩型系，其育性受2對隱性重疊不育基因（ms3ms3ms4ms4）和1對隱性上位抑制基因（espesp）互作控制。

參考文獻(xiàn)

[1]潘濤，曾凡亞，吳書惠，等.甘藍(lán)型低芥酸油菜雄性不育兩用系的選育與利用研究[J].中國油料，1988（3）：5-8.

[2]李樹林，周志疆，周熙榮.甘藍(lán)型油菜隱性核不育系S45AB的遺傳[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1993，9（4）：1-7.

[3]候國佐，王華，張瑞茂，等.甘{型油菜細(xì)胞核雄性不育材料 117A的遺傳研究[J].中國油料，1990（2）：7-10.

[4]李樹林，錢玉秀，吳志華.甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育性的遺傳規(guī)律探討及其應(yīng)用[J].上海農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1985，1（2）：1-12.

[5]陳鳳祥，胡寶成，李強(qiáng)生，等.甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育材料 9012A的發(fā)現(xiàn)與初步研究[J].北京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，1993，19（增刊）下：57-61.

[6]陳鳳祥，胡寶成，李成，等.甘藍(lán)型油菜隱性細(xì)胞核雄性不育完全保持系選育成功[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1995，28（5）：94-95.

[7]陳鳳祥，胡寶成，李成，等.甘藍(lán)型油菜細(xì)胞核雄性不育性的遺傳研究Ⅰ.隱性核不育系9012A的遺傳[J].作物學(xué)報(bào)，1998，24（4）：431-438.

[8]韓宏仕，我國甘藍(lán)型油菜隱性上位互作核不育三系的研究與利用[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)2006，34（2）：71-74.

[9]陳大倫，張瑞茂，李敏，胡騰文，等.甘藍(lán)型油菜隱性上位細(xì)胞核雄性不育三系的轉(zhuǎn)育方[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué)2007，5（2）：31-33.

[10]陳芝能，曾慶鴻，張瑞茂，等.油菜雙隱性基因細(xì)胞核+廣恢型細(xì)胞質(zhì)雄性不育三系的選育方法及其遺傳學(xué)基礎(chǔ)[J].種子，2007，9（2）：30-32.

[11]董發(fā)明，洪登峰，劉平武，等.油菜雙隱性基因細(xì)胞核+廣恢型細(xì)胞質(zhì)雄性不育三系的選育方法及其遺傳學(xué)基礎(chǔ)[J].華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，3（2）：13-16.

遺傳學(xué)重疊效應(yīng)范文2

>> 基于單片段代換系的水稻抽穗期QTL定位及上位性分析 水稻抽穗期管理注意事項(xiàng) 水稻抽穗期基因qHY—8對植株干物質(zhì)積累及產(chǎn)量性狀的影響 水稻抽穗期QTL鑒定及重疊群作圖 水稻抽穗期分子生物學(xué)研究進(jìn)展 水稻抽穗期QTL的聚合及其互作分析 普通小麥抽穗期控制基因TaHd1研究進(jìn)展與展望 馬鈴薯連作栽培對土壤微生物多樣性的影響 多樣性間套種栽培技術(shù) 多效唑與氮磷鉀肥配合運(yùn)用減輕小麥抽穗期漬澇研究 環(huán)形RNAs形成機(jī)制的多樣性 團(tuán)隊(duì)多樣性對員工創(chuàng)新的影響機(jī)制研究：一個跨層次研究 城市化影響下植物多樣性研究 氣候變化對生物多樣性的影響 森林對生物多樣性的影響及保護(hù) 云南旱災(zāi)對生物多樣性的影響 氮磷污染對生物多樣性的影響 植物多樣性及其對景觀的影響 多樣性對企業(yè)績效的影響綜述 外來入侵植物對生物多樣性的影響 常見問題解答 當(dāng)前所在位置：l）。基因效應(yīng)分析采用單因素方差分析，單因素（如Hd1等位基因變異）對總表型變異的貢獻(xiàn)率R2=SSintergroup/SSoverall，其中SSintergroup為組間方差，SSoverall為總方差；F1雜種播始期超親天數(shù)占親本播始期比例MP1=[（F1-P1）/P1]×100%，其中F1為F1雜種播始期，P1為早抽穗親本的播始期（計(jì)算超親早抽穗時間）或晚抽穗親本的播始期（計(jì)算超親晚抽穗時間）。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本材料及其F1雜種的播始期

表1的結(jié)果表明，親本材料和F1組合的播始期表現(xiàn)廣泛變異，親本材料播始期59～101 d，F(xiàn)1材料播始期60～120 d；通過計(jì)算F1雜種與兩親本播始期的相關(guān)系數(shù)，表明F1播始期與不育系的播始期沒有顯著的相關(guān)性，但是和恢復(fù)系播始期呈極顯著正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)為r=0.77（P

與雙親相比，少數(shù)F1雜種播始期表現(xiàn)出超親現(xiàn)象，6份F1雜種表現(xiàn)出較強(qiáng)的超親晚抽穗，除雜交組合HD9802S/HR015的超親晚抽穗天數(shù)占遲抽穗親本播始期比例的8.4%外，其余5份雜交組合為18.8%～20.2%。7份材料表現(xiàn)出超親早抽穗，超親早抽穗天數(shù)占早抽穗親本播始期比例的5.6%～13.0%；相同的恢復(fù)系與不同的不育系會產(chǎn)生超親F1，相同的不育系與不同的恢復(fù)系也會產(chǎn)生超親F1，因此F1的生育期超親表現(xiàn)與雙親的組配有關(guān)。

2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比對

選取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），對其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a啟動子序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增測序分析。除Hd1基因存在4種不同的等位基因外，其余基因均無差異。與日本晴Hd1編碼區(qū)相比，4個等位基因的編碼區(qū)分別表現(xiàn)出單核苷酸的替換、片段插入與缺失、無義突變等不同的SNP類型（圖2）。利用軟件預(yù)測分析，這4個等位基因分別編碼4種不同的蛋白質(zhì)（圖3）。通過與Takahashi等[2]對水稻Hd1序列及功能分析結(jié)果的比對確定本研究中的Hd1-1和Hd1-4為有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3則因?yàn)槌霈F(xiàn)了大片段的缺失，表現(xiàn)為功能缺失型等位基因。通過計(jì)算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者為86 d， 后者為83 d（表3），并且兩者呈顯著差異（P

通過分析F1雜種播始期與Hd1等位基因的關(guān)系，結(jié)果表明有功能Hd1純合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值為89 d，雜合型（HD1/hd1）為94 d，功能缺失型Hd1的純合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值為83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型與hd1/hd1基因型的播始期均表現(xiàn)出顯著差異（P

3 討論

3.1 Hd1等位基因變異是長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎(chǔ)之一

本研究選取的雜交稻骨干親本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的編碼區(qū)以及Hd3a的啟動子序列非常保守，沒有表現(xiàn)出差異，Hd1的編碼區(qū)表現(xiàn)出了4種不同等位基因類型，并且不同類型Hd1等位基因解釋了自然日照條件下抽穗期19.75%的表型變異；因此，本研究結(jié)果表明Hd1等位基因多態(tài)性是我國長江流域雜交秈稻骨干親本抽穗期變異的遺傳基礎(chǔ)之一。

3.2 關(guān)于F1雜種抽穗期的超親現(xiàn)象

親本間感光性和基本營養(yǎng)生長性組合的多樣性及強(qiáng)弱的不同使得F1雜種抽穗期呈現(xiàn)多種多樣的變化。在雜種優(yōu)勢利用，特別是秈粳亞種間雜種優(yōu)勢的利用中，常遇到超親晚熟現(xiàn)象，而許多研究表明，F(xiàn)1雜種抽穗期是否嚴(yán)重超親主要取決于雙親是否帶有不同位點(diǎn)的互補(bǔ)的顯性感光基因[3-5]，如果帶有一對互補(bǔ)基因，那么F1將會表現(xiàn)超親晚抽穗；徐俊鋒[6]的研究結(jié)果表明F1超親晚抽穗主要受兩對顯性互補(bǔ)感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，雜種超親晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出現(xiàn)了抽穗期超親的雜交組合，其中不育系親本814A和HD9802S與恢復(fù)系親本HR020和HR935配組的F1超親晚抽穗天數(shù)與晚抽穗親本播始期的比例為18.8%～20.2%，而且不育系親本含有有功能的Hd1等位基因，而恢復(fù)系親本含有功能缺失型等位基因，因此存在潛在的互補(bǔ)基因的可能。

Chang等[7]對感光品種的感光性（PSP）和基本營養(yǎng)生長性（BVP）同時進(jìn)行研究，認(rèn)為PSP受單一顯性基因或2個顯性基因（Se）控制，BVP則受2個或2個以上基因（Ef）控制，這些基因具有累加效應(yīng)，短的BVP相對于長的BVP為顯性，因此不同Ef基因在F1材料中的互補(bǔ)可能會導(dǎo)致營養(yǎng)生長期比雙親的縮短，從而導(dǎo)致提前抽穗[8]，因此還需要進(jìn)一步的試驗(yàn)去驗(yàn)證本研究中的超親早抽穗是否也是由Ef基因?qū)е碌摹?/p>

參考文獻(xiàn)：

[1] TSUJI H， TAMAKI S， KOMIYA R， et al. Florigen and the photoperiodic control of flowering in rice[J]. Rice，2008，1（1）：25-35.

[2] TAKAHASHI Y， TESHIMA K M.， YOKOI S，et al. Variations in Hd1 proteins， Hd3a promoters， and Ehd1 expression levels contribute to diversity of flowering time in cultivated rice[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2009，106（11）：4555-4560.

[3] 董世鈞，李春壽，李關(guān)土，等. 水稻秈粳雜種一代生育期的表現(xiàn)[J].中國水稻科學(xué)，1995，9（2）：77-81.

[4] 李和標(biāo)，鄒江石.水稻秈粳亞種間F1生育期超親表現(xiàn)與遺傳分析[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，1992，8（1）：7-12.

[5] 羅林廣，翟虎渠，萬建民，等.水稻抽穗期的遺傳學(xué)研究[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2001，17（2）：119-126.

[6] 徐俊鋒. 水稻主要雜交稻親本抽穗期基因型分析及秈粳交F1抽穗期超親分析[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2004.

遺傳學(xué)重疊效應(yīng)范文3

關(guān)鍵詞：RQ-PCR；熒光探針；分子生物；熒光共振能量轉(zhuǎn)移

中圖分類號：O657 文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A 文章編號：1009-2374（2013）13-0044-02

1 RQ-PCR技術(shù)概述

RQ-PCR是FPET（熒光共振能量轉(zhuǎn)移）技術(shù)在PCR定量上的應(yīng)用。其指在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，在指數(shù)擴(kuò)增期間通過連續(xù)監(jiān)測熒光信號出現(xiàn)的先后順序及強(qiáng)弱變化實(shí)時監(jiān)測整個PCR進(jìn)程，最后通過標(biāo)準(zhǔn)曲線對未知模板進(jìn)行定量分析的方法。RQ-PCR同步進(jìn)行定量和擴(kuò)增，這樣就克服了傳統(tǒng)PCR的平臺效應(yīng)，減少了終點(diǎn)檢測帶來交叉污染的機(jī)會，也克服了終點(diǎn)法定量的不準(zhǔn)確性。另外，RQ-PCR無需再處理，節(jié)約了時間和精力，更避免了放射性同位素可能給實(shí)驗(yàn)人員造成的傷害。目前，RQ-PCR在分子生物學(xué)研究中應(yīng)用越來越多。

1.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移

當(dāng)一個熒光基團(tuán)的熒光光譜與另一個熒光基團(tuán)的激發(fā)光譜重疊，并且兩個基團(tuán)距離足夠近時，供體熒光基團(tuán)的激發(fā)能誘發(fā)受體基團(tuán)發(fā)出熒光，同時供體熒光基團(tuán)自身的熒光強(qiáng)度衰減，即能量從短波長的熒光基團(tuán)傳遞到長波長的熒光基團(tuán)，相當(dāng)于短波長熒光基團(tuán)釋放的熒光被屏蔽，這個過程稱為FRET。

1.2 參照物

參照物有外參照和內(nèi)參照兩種。外參照不與目的基因在同一反應(yīng)體系中擴(kuò)增。以已知濃度的目的基因?yàn)槟０灏匆欢ū壤♂專苽錁?biāo)準(zhǔn)曲線。而未知標(biāo)本則根據(jù)該標(biāo)準(zhǔn)曲線得出相對的拷貝數(shù)和Ct值。其優(yōu)點(diǎn)是可以和目的基因保持較高的同源性，保證了二者的擴(kuò)增效率近似。缺點(diǎn)是不能克服也無法檢測可能出現(xiàn)在樣本反應(yīng)體系中的影響因素。內(nèi)參照是在各標(biāo)本中加入已知濃度的內(nèi)參照基因，與樣本一起抽提、擴(kuò)增。內(nèi)參照基因的DN段與目的基因相似。為保證目的基因只能與內(nèi)參照探針結(jié)合，運(yùn)用定點(diǎn)突變的方法改變與探針結(jié)合的中間部位的序列。內(nèi)參照系統(tǒng)的結(jié)果重復(fù)性更好，可以避免不同抽提效率導(dǎo)致的樣本間差異。

1.3 RQ-PCR幾個重要參數(shù)

（1）熒光域值3～15個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍設(shè)置為熒光域值的缺省，熒光本底信號為PCR反應(yīng)的前15個循環(huán)的熒光信號；（2）Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定閾值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)；（3）Ct值與起始模板的關(guān)系研究表明，每個模板的Ct值與該模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小，利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，當(dāng)獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。

2 RQ-PCR技術(shù)的關(guān)鍵

RQ-PCR技術(shù)在常規(guī)PCR基礎(chǔ)上添加了熒光染料或探針。特異的將雙鏈DNA摻入熒光染料中，保證其信號與PCR產(chǎn)物完全同步遞增。在探針的3’端和5’端分別標(biāo)記淬滅基團(tuán)（Q）和報(bào)告基團(tuán)（R），進(jìn)行能量的傳遞。R基團(tuán)所發(fā)出的熒光可被Q基團(tuán)吸收或抑制；抑制作用隨著兩者距離變遠(yuǎn)而消失，R基團(tuán)增強(qiáng)后的熒光信號可以被熒光監(jiān)測系統(tǒng)接收到。當(dāng)熒光信號增強(qiáng)到某一閾值時，Ct值被記錄下來。這樣，通過未知樣品的Ct值和標(biāo)準(zhǔn)曲線就可以將該樣品的起始拷貝數(shù)確定。因此，在RQ-PCR中，熒光染料或探針就成為了技術(shù)關(guān)鍵。目前已經(jīng)開發(fā)出的熒光染料和探針按照能量轉(zhuǎn)移和基團(tuán)標(biāo)記的方式，大體可以分為水解類探針和雜交類探針兩類。

2.1 Taq Man探針法

在該探針的3’末端和5’末端分別標(biāo)記Q基團(tuán)和R基團(tuán)，使其與兩引物所包含的一段序列內(nèi)DNA模板完全互補(bǔ)。當(dāng)探針完整時，利用Taq酶5’3’外切酶的活性，Q基團(tuán)吸收R基團(tuán)的熒光，熒光信號也就不能被檢測到；相反如果正確的底物被擴(kuò)增出來后，即有特異的PCR發(fā)生時，探針就會在復(fù)性階段與其雜交，當(dāng)聚合酶延伸到探針時，它就會將與模板雜交上的探針切碎，使得R基團(tuán)和Q基團(tuán)分開，解除淬滅作用，從而釋放出熒光信號，可通過檢測系統(tǒng)觀察到信號的變化。每擴(kuò)增一條DNA鏈，就會有一個游離的熒光分子形成，實(shí)現(xiàn)了熒光信號累積與PCR產(chǎn)物形成完全同步，進(jìn)而計(jì)算出Rn值、Rn值、Ct值和閾值。通過計(jì)算就可以獲得起初模板量。常用的熒光基團(tuán)是VIC、TET、FAM、HEX。

2.2 非特異性雙鏈DNA嵌入染料

SYBR Green 1是一種與雙鏈DNA結(jié)合的染料。當(dāng)它游離在溶液中時，不發(fā)出熒光；但當(dāng)其摻入DNA雙鏈后，會發(fā)出強(qiáng)烈熒光。該染料最大的優(yōu)點(diǎn)是可以作用于任何模板的任何引物。但由于其對DNA模板沒有選擇性，可能會造成定量不準(zhǔn)確。若想解決這個問題，可以使用比較由于融解曲線法，還可以通過反應(yīng)條件的優(yōu)化及嚴(yán)格設(shè)計(jì)高特異性引物，降低引物二聚體形成的可能性。

2.3 分子信標(biāo)

分子信標(biāo)由Tyagi和Krammertm建立，適用于鑒定點(diǎn)突變。該探針是單鏈DNA所形成的呈發(fā)卡結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸，環(huán)部部分堿基同靶DNA序列互補(bǔ)，長度為15～35個核苷酸；莖部有互補(bǔ)配對的堿基組成，同靶DNA無序列同源性，約5～7個核苷酸長。在探針的5’端標(biāo)記R基團(tuán)，3’端標(biāo)記Q基團(tuán)。當(dāng)分子信標(biāo)游離時，由于R、Q兩個基團(tuán)緊密相鄰，熒光被淬滅。而在PCR變性后的復(fù)性階段，分子信標(biāo)與溶液中的特異模板雜交，靶DNA序列與分子信標(biāo)環(huán)部的核苷酸序列互補(bǔ)結(jié)合，使發(fā)卡結(jié)構(gòu)破壞，釋放出熒光信號，淬滅作用被解除。由于熒光強(qiáng)度會隨著分子信標(biāo)量的增加而增加，從而達(dá)到定量檢測的目的。在PCR的延伸階段，分子信標(biāo)與模板解離，再次形成發(fā)卡結(jié)構(gòu)，熒光消失。每次擴(kuò)增后產(chǎn)物的積累量可以通過當(dāng)時的熒光強(qiáng)度的增加來反映。該方法的優(yōu)點(diǎn)是探針可循環(huán)利用，缺點(diǎn)是標(biāo)記相對復(fù)雜。同時，莖部結(jié)構(gòu)的高熱力學(xué)溫度會影響探針和靶序列的雜交。

2.4 雜交探針

雙雜交探針也是以FRET為原理進(jìn)行的。該方法使用四個寡聚核苷酸分子、兩個引物和兩個探針。發(fā)光探針的5’端標(biāo)記一個R基團(tuán)，淬滅探針的3’端標(biāo)記Q基團(tuán)，雜交時R基團(tuán)緊密相鄰Q基團(tuán)，以首尾相接的方式退火靶擴(kuò)增子，當(dāng)循環(huán)儀的光源激發(fā)3’端的Q基團(tuán)后，產(chǎn)生從供體到毗鄰探針R基團(tuán)的FRET使熒光淬滅。起始模板的量越高，熒光淬滅的程度越低，以此可以進(jìn)行PCR的定量分析。該方法的優(yōu)點(diǎn)是淬滅效率高，缺點(diǎn)是擴(kuò)增效率不穩(wěn)定，合成成本相對較高。

3 RQ-PCR技術(shù)的應(yīng)用

3.1 基因工程研究領(lǐng)域

RQ-PCR技術(shù)的出現(xiàn)加強(qiáng)了對基因的量和質(zhì)變化的研究。它目前已經(jīng)在遺傳分析中廣泛應(yīng)用以檢測基因突變及基因組的不穩(wěn)定性。

（1）基因表達(dá)研究由于探針雜交的效率和其后的切除與雜交有關(guān)，可以將由不同熒光報(bào)告基團(tuán)標(biāo)記的探針與野生型和突變基因雜交，2005年劉敬忠等使用RQ-PCR技術(shù)對β地中海貧血純、雜合子作出診斷。目前對遺傳性物質(zhì)改變引起的疾病還無法根治，而應(yīng)用RQ-PCR技術(shù)可以通過產(chǎn)前監(jiān)測和產(chǎn)前基因診斷來減少病嬰出生。

（2）轉(zhuǎn)基因研究Tesson等確定了分析轉(zhuǎn)基因鼠接合性的RQ-PCR技術(shù)使用條件，利用合適的循環(huán)域值及發(fā)光探針，擴(kuò)增一個轉(zhuǎn)移后的基因和一個對照基因。通過RQ-PCR檢測，同型結(jié)合的和異質(zhì)接合的動物后其子代中轉(zhuǎn)基因的傳遞情況與孟德爾遺傳規(guī)律相符。這項(xiàng)技術(shù)可以廣泛地應(yīng)用于基因劑量功效實(shí)驗(yàn)和轉(zhuǎn)基因動物的繁育中。

（3）單核苷酸多態(tài)性與突變的分析RQ-PCR可以用來檢測基因突變和基因組的不穩(wěn)定性。一條橫跨突變位點(diǎn)的探針和一條錨定探針是檢測基因突變的基礎(chǔ)。兩條探針用兩種不同的發(fā)光基團(tuán)標(biāo)記。如果靶序列中無突變，探針雜交便完全配對；如果靶序列和探針不完全配對，會降低雜交體的穩(wěn)定性和熔解溫度。這樣便可對突變和多態(tài)性進(jìn)行分析。

3.2 醫(yī)學(xué)研究領(lǐng)域

（1）病原體檢測2000年蘇學(xué)飛等利用該技術(shù)對淋球菌、沙眼衣原體、解脲支原體、人類瘤病毒、單純皰疹病毒五個項(xiàng)目進(jìn)行了定量測定。2004年針對SARS流行性病的檢測和診斷使得RQ-PCR技術(shù)得以應(yīng)用和發(fā)展。近年來，TaKaRa公司推出的試劑盒可以一步完成對H5N1、H7N9等禽流感病毒的檢測。

（2）腫瘤診斷基因發(fā)生了變異是腫瘤產(chǎn)生的根本，RQ-PCR方法可以將這些異常變化都檢測出來。許多癌基因的突變和表達(dá)增加，在腫瘤早期就出現(xiàn)。除了能夠有效地檢測基因突變，RQ-PCR還能夠準(zhǔn)確地檢測到癌變基因的表達(dá)量。隨著與腫瘤相關(guān)的新基因被不斷地發(fā)現(xiàn)，會使RQ-PCR技術(shù)在腫瘤的研究中發(fā)揮越來越大的作用。

（3）抗藥性考核日本Funato等使用RQ-PCR技術(shù)對臨床樣品中如MRP、MDR21等與抗藥性相關(guān)的基因表達(dá)進(jìn)行了檢測。結(jié)果表明，RQ-PCR技術(shù)可以可靠地定量檢測抗藥基因的表達(dá)，運(yùn)用該技術(shù)可以對化療可能引起的反應(yīng)進(jìn)行預(yù)測。

4 結(jié)語

現(xiàn)在，RQ-PCR技術(shù)不僅快速、靈敏、準(zhǔn)確，而且己經(jīng)發(fā)展為一項(xiàng)高度自動化的核酸定量技術(shù)，大大降低了假陽性率，提高了工作效率，且不必使用對人體有害的染色劑。因此該技術(shù)被廣泛地應(yīng)用在基因表達(dá)研究、基因單核苷酸多態(tài)性和遺傳性疾病診斷、病原微生物診斷等諸多科研領(lǐng)域。但與傳統(tǒng)的PCR技術(shù)相比，RQ-PCR也存在不足之處：（1）RQ-PCR在復(fù)合式檢測方面的應(yīng)用能力會因檢測光源和熒光素種類的局限所限制；（2）由于檢測環(huán)境相對封閉，減少了擴(kuò)增后電泳的檢測步驟，也就無法對擴(kuò)增產(chǎn)物的大小進(jìn)行監(jiān)測；（3）RQ-PCR實(shí)驗(yàn)的高成本也限制了其廣泛的應(yīng)用。

參考文獻(xiàn)

[1] 韓俊英，曾瑞萍.熒光定量PCR技術(shù)及其應(yīng)用[J].國外醫(yī)學(xué)?遺傳學(xué)分冊，2000，23（3）：177.

[2] 王行，王惠民.實(shí)時定量PCR技術(shù)的方法學(xué)分類[J].臨床檢驗(yàn)雜志，2007，25（1）：71-72.

遺傳學(xué)重疊效應(yīng)范文4

關(guān)鍵詞分子標(biāo)記;概念;基本原理;特點(diǎn)

中圖分類號Q78文獻(xiàn)標(biāo)識碼A文章編號 1007-5739(2009)11-0264-07

隨著人們對生命認(rèn)識的不斷加深以及遺傳學(xué)的不斷深入發(fā)展,越來越多的遺傳標(biāo)記被發(fā)現(xiàn),遺傳標(biāo)記的種類和數(shù)量越來越多。主要分為4種類型,即形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞學(xué)標(biāo)記、生化標(biāo)記和DNA分子標(biāo)記。顯然,前3種標(biāo)記都是以基因表達(dá)的結(jié)果(表現(xiàn)型)為基礎(chǔ),是對基因的間接反映;而DNA分子標(biāo)記則是DNA水平遺傳變異的直接反映。與表型標(biāo)記相比,DNA分子標(biāo)記具有能對各發(fā)育時期的個體、各個組織、器官甚至細(xì)胞作檢測,既不受環(huán)境的影響,也不受基因表達(dá)與否的限制,數(shù)量豐富,遺傳穩(wěn)定,對生物體的影響表現(xiàn)“中性”以及操作簡便等特點(diǎn)。分子標(biāo)記的所有這些特性,奠定了它具有廣泛應(yīng)用性的基礎(chǔ)[1-2]。

1分子標(biāo)記的來源及定義

1.1分子標(biāo)記的來源

“標(biāo)記”一詞,根據(jù)漢語大詞典的解釋,是“便于識別的標(biāo)識或者記號”。隨著人們對生命本質(zhì)認(rèn)識的一步步加深,在人們研究DNA序列時發(fā)現(xiàn)了大量的非編碼序列,甚至占到了全序列的90%以上。這些非編碼序列具有特殊的一級結(jié)構(gòu),如串聯(lián)重復(fù)、回文結(jié)構(gòu)、Alu序列(反向重復(fù)序列)、CpG島等,并且全基因組分布[3]。隨著人類基因組計(jì)劃的人類基因組框架草圖的完成和一個個模式生物的全基因組測序,一個個新的DNA特異序列被發(fā)現(xiàn)并且在染色體上定位,整個基因組內(nèi)的標(biāo)記密度越來越高,并且大量的特異序列與不同的基因片段有著不同程度的連鎖,所有這些標(biāo)記構(gòu)成了人類研究探索各種生物基因組DNA的地圖與路標(biāo)。

1.2分子標(biāo)記的定義

廣義的分子標(biāo)記指可遺傳并可檢測的DNA序列或者蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)標(biāo)記包括種子貯藏蛋白和同工酶(不同基因位點(diǎn)編碼的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位點(diǎn)上不同的等位基因編碼的酶的不同形式)。狹義的分子標(biāo)記僅僅指DNA標(biāo)記,一般所稱的分子標(biāo)記即被界定在此范圍之內(nèi)[4]。這是因?yàn)樵趹?yīng)用上DNA標(biāo)記比蛋白質(zhì)標(biāo)記廣泛的多。蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)比DNA的結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多。構(gòu)成蛋白質(zhì)的氨基酸有幾十種,而構(gòu)成DNA的堿基只有4種,通過指數(shù)級的排列方式僅是其一級結(jié)構(gòu)的可能性就有數(shù)量級上的差異,且不計(jì)蛋白質(zhì)更加復(fù)雜的二級、三級、四級結(jié)構(gòu)及其結(jié)構(gòu)域。并且到目前為止,蛋白質(zhì)的復(fù)制與合成遠(yuǎn)不及DNA復(fù)制技術(shù)成熟,可控性也不高。因此,蛋白質(zhì)標(biāo)記應(yīng)用遠(yuǎn)不如DNA標(biāo)記方便和廣泛。但從更嚴(yán)格的意義上講,蛋白質(zhì)標(biāo)記是研究生命現(xiàn)象更為精確的標(biāo)記,因?yàn)槠涓€(wěn)定、多態(tài)性更高,每種蛋白質(zhì)都是唯一的(序列唯一、構(gòu)象唯一)。

1.3理想的分子標(biāo)記

理想的分子標(biāo)記必須達(dá)到以下要求:①具有高多態(tài)性;②共顯性遺傳,即利用分子標(biāo)記可鑒別二倍體中雜合和純合基因型;③能明確辨別等位基因;④遍布整個基因組;⑤除特殊位點(diǎn)的標(biāo)記外,要求分子標(biāo)記均勻分布于整個基因組;⑥選擇中性(即無基因多效性);⑦檢測手段簡單、快速(如實(shí)驗(yàn)程序易自動化);⑧開發(fā)成本和使用成本盡量低廉;⑨在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)空間重復(fù)性好(便于數(shù)據(jù)交換)[5]。

特別需要提出的是,所有的分子標(biāo)記都必須滿足和某個基因或者已知標(biāo)記緊密連鎖(連鎖程度越高越好)甚至共分離。

但是,目前發(fā)現(xiàn)的任何一種分子標(biāo)記均無法同時滿足以上所有要求。使用者可以根據(jù)自己的實(shí)驗(yàn)?zāi)康暮鸵缶唧w選用某種標(biāo)記技術(shù)。

2目前常用分子標(biāo)記的基本原理

2.1限制性片斷長度多態(tài)性(RFLP)

限制性片斷長度多態(tài)性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性內(nèi)切酶處理不同生物個體的DNA所產(chǎn)生的分子片斷大小的差異。此技術(shù)基于生物個體的基因組的變異,是研究不同基因組間的差異的技術(shù),由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物種經(jīng)過長期的進(jìn)化,各個種屬甚至品種之間的同源DNA序列上的限制性內(nèi)切酶識別位點(diǎn)不同,或者由于突變、重組等原因引起限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)上的核苷酸的變化。若引起DNA分子某一特定內(nèi)切酶識別位點(diǎn)序列內(nèi)發(fā)生變化,這樣該位點(diǎn)就不能被切開,使得DN段比親本長;若突變后形成新的酶切位點(diǎn),則酶切后的片斷變短。這樣,通過電泳可以將大小不同的片斷區(qū)分開來。對于分子量較小的質(zhì)粒DNA就可直接觀察到DNA長度的差異,但對于核DNA而言,DN斷呈連續(xù)分布,無法辨別差異,需通過Southern雜交轉(zhuǎn)移至支持膜上,用單拷貝或低拷貝的DNA克隆作為探針與膜上的酶切片斷雜交,通過放射自顯影或非同位素顯色技術(shù),發(fā)生變異的材料顯示的帶就可能與親本的帶處于不同位置。檢測出與此標(biāo)記DNA相關(guān)的片段構(gòu)建出多態(tài)性圖譜,即為RFLP[5,6]。這種特定的限制性片斷與DNA探針的組合,便可以作為遺傳標(biāo)記。由于RFLP起源于DNA的變異,不受顯隱性關(guān)系、環(huán)境條件和發(fā)育階段的影響,具有遺傳的專一性和穩(wěn)定性的特點(diǎn),在數(shù)量上不受限制,可隨機(jī)選取足夠數(shù)量能代表整個基因組的RFLP標(biāo)記,而且每個標(biāo)記變異大,檢測方便。用于檢測RFLP的克隆探針可隨機(jī)選取,可以是使核糖體DNA、葉綠體DNA,也可以是總DNA。這樣就可以獲得能夠反映遺傳差異的大量多態(tài)性,為進(jìn)行資源分析、品種鑒定、物種進(jìn)化、基因定位、親緣關(guān)系和遺傳距離的分析,遺傳圖譜的構(gòu)建提供了有力的工具。并且RFLP是共顯性標(biāo)記,能夠區(qū)別出雜合體與純合體[7]。雖然RFLP具有結(jié)果穩(wěn)定可靠,重復(fù)性好,特別適合建立連鎖圖等優(yōu)點(diǎn),但也具有檢驗(yàn)步驟多、周期長、成本高等缺點(diǎn)。并且RFLP對DNA多態(tài)性檢出的靈敏性不高,RFLP連鎖圖譜上還有很大的空間區(qū)(gap),甚至在使用同位素時可能對人有一定的傷害等等,這些都是需要進(jìn)一步完善的地方。

2.2隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)

隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美國杜邦公司的Williams和加利福尼亞生物研究所的Welsh等領(lǐng)導(dǎo)的2個小組于20世紀(jì)90年代同時開發(fā)出來的一種新的DNA指紋技術(shù)。此技術(shù)是應(yīng)用一系列隨機(jī)引物擴(kuò)增并尋找多態(tài)性DN段的遺傳標(biāo)記技術(shù)。這一技術(shù)建立于PCR反應(yīng)基礎(chǔ)之上,以隨機(jī)的短脫氧核苷酸(通常為10個堿基)作為PCR引物,對基因組DNA進(jìn)行擴(kuò)增而產(chǎn)生多態(tài)的DNA圖譜。擴(kuò)增產(chǎn)生的片段可通過瓊脂糖電泳或聚丙烯酰胺凝膠電泳分開,經(jīng)溴化乙錠染色或銀染色得到多態(tài)性的DNA圖譜后進(jìn)行多態(tài)性觀察。在基因組上,每個引物可以連續(xù)直接擴(kuò)增特定的DN段,對一個特定的基因型來講,這些擴(kuò)增的片段或片段的類型是唯一的。它的應(yīng)用是基于這樣的一個理論:對于同一模板DNA,用同一引物擴(kuò)增既可能得到相同的帶譜(模板基因組間可能具有同源性),也可能得到不同的帶譜。僅在某一特定模板中出現(xiàn)的條帶即可作為該模板的分子標(biāo)記[8,9]。事實(shí)上,不同基因組DNA總是有一定差異的,所以用RAPD即可進(jìn)行分子標(biāo)記研究。理論上講,在一定的擴(kuò)增條件下,擴(kuò)增的條帶數(shù)取決于基因組的復(fù)雜性。對特定的引物,復(fù)雜性越高的基因組所產(chǎn)生的擴(kuò)增條帶數(shù)也越多。

RAPD所用的一系列引物的DNA序列雖然各不相同,但對于某一特定引物來說,它同基因組DNA序列有特定的互補(bǔ)區(qū)域。這些特定區(qū)域在基因組的分布如果符合PCR擴(kuò)增的反應(yīng)條件的話,即引物在模板上的2條鏈如果有互補(bǔ)位置并且與引物的3′端在200bp以內(nèi),就可以擴(kuò)增出這一片段。如果基因組在這些區(qū)域內(nèi)發(fā)生插入、缺失或者替換即可導(dǎo)致這些特定的結(jié)合位置分布發(fā)生變化而使PCR產(chǎn)物發(fā)生增加、缺失或者分子量發(fā)生改變,通過對PCR產(chǎn)物的檢測,即可找出基因組DNA在這些區(qū)域內(nèi)的多態(tài)性[10]。由于RAPD分析時所用的引物數(shù)量極大,并且引物序列隨機(jī),雖然對某一引物而言檢測的區(qū)域有限,但是利用一系列引物可以檢測的區(qū)域幾乎可以覆蓋整個基因組。與RFLP是從一系列酶切片段中尋找多態(tài)性片段不同,RAPD是利用PCR隨機(jī)合成多態(tài)性DN段,檢測被擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)的遺傳特征變化。其具體優(yōu)點(diǎn)體現(xiàn)在:①極大的豐富性,能反映整個基因組的變化;②強(qiáng)大的可探測性,無需合成特定的引物;③高效性與靈敏性。短期內(nèi)可以得到大量的擴(kuò)增片段,只要是遺傳特異性的發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個體也可以識別出[11]。

RAPD最大的特點(diǎn)是引物的堿基序列是隨機(jī)的,所用引物通常多達(dá)幾百種,并且1套引物可以用作多個物種或者群體,所以RAPD技術(shù)在用于遺傳多樣性和品種鑒定的研究中具有極大的優(yōu)越性。因此,用來鑒定品種純度是很有用的。據(jù)報(bào)道[9],從玉米、大豆、小麥及紅三葉草干種子中提取DNA并成功地利用RAPD技術(shù)擴(kuò)增DN段;中國科學(xué)院遺傳所陳洪等利用OPP-18引物成功地鑒定了雜交水稻汕優(yōu)63雜種純度,鑒定結(jié)果與田間小區(qū)種植鑒定完全一致。RAPD技術(shù)反應(yīng)靈敏、多態(tài)性強(qiáng),操作簡便,速度快,費(fèi)用低,既有大量的隨機(jī)引物可供篩選之用,又不受種屬的限制,被廣泛用于多種作物的種子鑒定[9,11,12]。

由于是隨機(jī)引物對整個基因組進(jìn)行多態(tài)性檢測,在技術(shù)上簡單易行不需要克隆制備、同位素標(biāo)記、Southern印記等預(yù)備性工作,所需DNA樣品量少,安全性好,價格便宜,是繼RFLP之后應(yīng)用最廣的分子標(biāo)記。由于引物沒有特異性,1套引物可用于不同生物基因組的的分析,分析速度快,短期內(nèi)可得到大量的遺傳標(biāo)記,并克服了同工酶位點(diǎn)少和RFLP操作技術(shù)復(fù)雜的弊端,已經(jīng)廣泛應(yīng)用于遺傳作圖、基因定位和克隆、物種進(jìn)化及鑒定特殊染色體區(qū)段的鑒別和分離以及動植物育種等方面,特別是在尋找與目的基因連鎖的分子標(biāo)記方面,近年來報(bào)道了大量的與各種目的基因連鎖的RAPD標(biāo)記。水稻的Xa-21 基因和西紅柿的pto基因的成功分離就是首先找到了與目的基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記,然后通過定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。

與PCR相比,RAPD具有以下特點(diǎn):①RAPD使用的是隨機(jī)引物,不需要預(yù)先了解目的基因和相應(yīng)的序列;②操作簡便,實(shí)驗(yàn)周期短,能在較短的時間篩選大量樣品;③引物具有普遍適應(yīng)性,適用于自動化操作分析。

與RFLP相比,RAPD具有以下特點(diǎn):①RAPD分析只需要少量模板,1次擴(kuò)增僅需20~100ng,這對于DNA量很少的材料進(jìn)行基因組分析有利。比如對花粉粒、原生質(zhì)體、種子等的DNA分析是切實(shí)可行的。②RAPD標(biāo)記具有更大的隨機(jī)性,亦有利于圖譜的構(gòu)建。對于DNA含量大的和多倍體物種,RFLP探針會與多倍體的多個片段雜交,所得到的混合指紋會對其他等位基因的闡明帶來困難。而且由于DNA量較大,進(jìn)行單拷貝的Southern雜交不很實(shí)際,至少需要很長的曝光時間,并且已知的探針數(shù)量有限。RAPD大大增加了可構(gòu)建遺傳圖譜物種的數(shù)量。③無需借助于有傷害性的同位素,耗費(fèi)的人力物力少。④靈敏度高。引物中的個別堿基的變化會引起擴(kuò)增條帶和強(qiáng)度的劇烈變化,這是RFLP所無法比擬的。短期內(nèi)可以得到大量的擴(kuò)增片段,只要是遺傳特異性發(fā)生變化,即使親緣關(guān)系很近的個體也可以識別出。⑤RAPD標(biāo)記可以覆蓋整個基因組,包括編碼和非編碼區(qū),可以反映整個基因組的變化。但是,由于引物的競爭性等,基因組的RAPD位點(diǎn)有時不能全部檢出,造成假象上的差異,這在種屬親緣關(guān)系的研究上尤其明顯。⑥RAPD產(chǎn)物有大于50%的條帶擴(kuò)增于單拷貝區(qū),經(jīng)過克隆和序列分析后,可作為RFLP和原位雜交的探針,在基因定位、克隆及輔助選擇育種中可以廣泛應(yīng)用。

隨著RAPD日益廣泛的使用,其不足之處也逐漸顯現(xiàn),比如標(biāo)記的顯隱性位點(diǎn)性,致使其不能在后代中區(qū)分雜合體和純合體;穩(wěn)定性差,由于是單鏈引物隨機(jī)的結(jié)合,在眾多的反向重復(fù)序列上,每次的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可能不一致。解決辦法是對單鏈引物進(jìn)行篩選,優(yōu)化PCR條件;高度的變異性,即使在親緣關(guān)系很近的物種間,結(jié)果也可能差異極大;Tm值低的隨機(jī)引物易受外界環(huán)境影響,如Mg2+濃度等[8,9,14]。

由于RAPD技術(shù)是由多種成分參加的生化反應(yīng),反應(yīng)中各種成分均為微量,盡管其反應(yīng)靈敏度高,但是影響因素較多,故而RAPD受環(huán)境影響很大,穩(wěn)定性差,重復(fù)性也不好,因此對實(shí)驗(yàn)的設(shè)備、條件及其操作的一致性很嚴(yán)格,這又大大限制了它的使用。為了得到較穩(wěn)定的結(jié)果,各種反應(yīng)參數(shù)必須事先優(yōu)化選擇,操作中每一步都必須小心謹(jǐn)慎,以防止出現(xiàn)差錯。

2.3特征序列擴(kuò)增區(qū)域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)

RAPD標(biāo)記一般表現(xiàn)顯性遺傳,但若某RAPD片段不是重復(fù)序列,也可將其轉(zhuǎn)化為RFLP標(biāo)記。另外,為了提高某一理想RAPD標(biāo)記的穩(wěn)定性,可首先將其克隆并對其末端測序,之后,在原來RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此為引物對基因組DNA再行擴(kuò)增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)標(biāo)記[15]。

SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并應(yīng)用。SCAR標(biāo)記是在RAPD技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的。其基本步驟是:先作RAPD分析,然后把目標(biāo)RAPD片段(如與某目的基因連鎖的RAPD片段)進(jìn)行克隆和測序,根據(jù)原RAPD片段兩末端的序列設(shè)計(jì)特定引物(一般比RAPD引物長,通常24個堿基,是在原RAPD引物的3′與5′端延長14個堿基),利用兩端各24個堿基的引物再進(jìn)行PCR特異擴(kuò)增,這樣就可把與原RAPD片段相對應(yīng)的單一位點(diǎn)鑒定出來。這樣的位點(diǎn)就稱為SCAR。總的來說,SCAR比RAPD和其他利用隨機(jī)引物的方法在基因定位和作圖中的應(yīng)用更好,因?yàn)樗懈叩目芍貜?fù)性(原因是使用的引物長),標(biāo)記是共顯性遺傳的[16]。

該方法與RAPD相比,具體有如下優(yōu)點(diǎn):①由于有較長的引物,退火溫度較高,因此具有更高的檢測穩(wěn)定性;②有將顯性RAPD標(biāo)記轉(zhuǎn)化為共顯性的SCAR標(biāo)記的可能性;③如果是顯性標(biāo)記,則在檢測中可以直接染色而不需電泳檢測。另外,用RAPD找到擴(kuò)增片段后不再設(shè)計(jì)引物,而是直接測序后通過電腦軟件分析(如用ClustalX軟件進(jìn)行對位,MEGA軟件計(jì)算DNA序列間的差異百分率和轉(zhuǎn)換/顛換數(shù),UPGMA軟件建親緣關(guān)系樹狀圖等),找出特異性的堿基作為鑒定的特異性標(biāo)記[17]。

2.4與RAPD技術(shù)相近的分子標(biāo)記種類

下面提到的所有技術(shù)都是利用1個或2個短的富含GC堿基的隨機(jī)引物。

(1)DNA擴(kuò)增指紋圖譜(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。與RAPD技術(shù)不同的是,在DAF分析中,引物濃度更高,引物長度更短(一般5~8個堿基),只有2個溫度循環(huán)(在RAPD中是3個溫度循環(huán)),并且往往用聚丙烯酰胺凝膠電泳,DAF通常會產(chǎn)生非常復(fù)雜的帶型。

(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物較長(10~50個堿基),但PCR反應(yīng)前2個循環(huán)的嚴(yán)謹(jǐn)條件較低,最終的反應(yīng)結(jié)果與RAPD類似[19]。在AP-PCR分析中,擴(kuò)增分為3個部分,每個部分要求的條件和組分的濃度存在差異;在第1個PCR循環(huán)中,引物濃度較高;引物長度不定,并且常常來自為其他目的而設(shè)計(jì)的引物(如M13通用測序引物)。

2.5擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(AFLP)

擴(kuò)增片段長度多態(tài)性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦稱選擇性限制片段擴(kuò)增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷蘭Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年創(chuàng)建的一種新型的分子標(biāo)記,并于當(dāng)年獲得了歐洲專利局專利[20]。

它是RFLP和PCR相結(jié)合的分子標(biāo)記技術(shù),既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的靈敏性,多態(tài)性高。其基本原理是利用PCR技術(shù)選擇性擴(kuò)增基因組DNA雙酶切后產(chǎn)生的限制性片斷。基因組經(jīng)2種限制性內(nèi)切酶消化以后將一雙鏈DNA人工接頭(artificial adapter)連接于限制性片斷兩端。然后根據(jù)接頭序列和限制性位點(diǎn)附近的區(qū)域的堿基序列,設(shè)計(jì)一系列3′端含數(shù)個隨機(jī)變化的選擇性堿基的PCR引物進(jìn)行特異性條件擴(kuò)增,只有那些限制性位點(diǎn)的側(cè)翼序列與引物3′端選擇堿基相匹配的限制性片段才能得以擴(kuò)增。這些選擇性堿基數(shù)目的多少主要是由待測樣品的基因組大小決定,選擇性堿基數(shù)目多,選擇性就強(qiáng),擴(kuò)增產(chǎn)物就少;反之,其數(shù)目就少,選擇性弱,擴(kuò)增產(chǎn)物就多。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離顯示其多態(tài)性。當(dāng)不同基因組DNA中因?yàn)橥蛔円鹣拗菩晕稽c(diǎn)的數(shù)量發(fā)生改變或2個限制性位點(diǎn)之間的區(qū)域內(nèi)發(fā)生堿基插入、片段消失或順序重排時,電泳譜帶顯示多態(tài)性,多態(tài)性以擴(kuò)增片段的長短不同和數(shù)量多寡顯示出來[21]。

AFLP的技術(shù)特點(diǎn)包括以下幾個方面:①使用2種內(nèi)切酶消化模板DNA。一些酶的切割位點(diǎn)較多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位點(diǎn)較少,如PstI等等。采用雙酶切割的原因是:多切點(diǎn)酶產(chǎn)生小片段,便于凝膠分析切點(diǎn)數(shù)少的酶減少擴(kuò)增片段,由于AFLP反應(yīng)中擴(kuò)增片段是2個酶共同酶切的片段,這樣減少了選擇擴(kuò)增時所需的選擇堿基數(shù)。雙酶可以進(jìn)行單鏈標(biāo)記,從而防止電泳中因?yàn)殡p鏈泳動不均而產(chǎn)生的雙帶假象。并且可使少量引物產(chǎn)生許多不同的引物組合,從而產(chǎn)生大量的不同的AFLP指紋圖譜[22]。另外,不同物種基因組的AFLP過程中使用的限制性內(nèi)切酶也不盡相同。EcoRI可靠廉價,是6堿基內(nèi)切酶的首選。分析真核生物基因組時大多使用MseI(4堿基),因?yàn)镸seI的識別序列是TTAA,而真核生物基因組富含AT序列,與TaqI相比(其識別序列為TCGA),可以獲得更多的便于PCR擴(kuò)增和電泳分離的小片段DNA[23]。②AFLP的接頭為雙鏈寡核苷酸。人工合成時接頭未進(jìn)行磷酸化處理,所以只有1條單鏈連接于酶切片段的末端。③與常規(guī)的PCR相比,AFLP的引物有其獨(dú)特性。其引物有3部分構(gòu)成:與接頭互補(bǔ)的核心序列、內(nèi)切酶識別序列以及3′末端的選擇性堿基。該類引物的一個重要特征是通常以鳥苷酸G開頭,這樣可以有效的形成雙鏈,不過當(dāng)dNTP濃度過低時容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)。此外,選擇性堿基的數(shù)目影響著AFLP反應(yīng)的特異性。研究表明,引物帶有1~3個選擇性堿基時擴(kuò)增的選擇性較好。當(dāng)選擇性堿基超過4個時,擴(kuò)增的錯配程度超過了允許程度,故而AFLP的選擇性堿基數(shù)目一般不超過3個,具體數(shù)目取決于基因組的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因組時用EcoRI+2(2個選擇性堿基)/MseI+3引物組,500~6 000 Mbp的基因組應(yīng)采取EcoRI+3/MseI+3較為嚴(yán)謹(jǐn)?shù)囊锝M。微生物通常采用1個選擇性堿基的引物組[24]。④AFLP的PCR擴(kuò)增分兩步進(jìn)行。首先預(yù)擴(kuò)增,其擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)過一定比例稀釋后,以此為模板再進(jìn)行選擇性擴(kuò)增。兩步擴(kuò)增可以減少擴(kuò)增產(chǎn)物中的非特異性帶,降低了不清晰電泳造成的指紋圖譜的背景,提高了指紋圖譜的清晰度,還可以增加擴(kuò)增片段數(shù),為AFLP分析提供充足的模板。

AFLP技術(shù)不僅具有其他分子標(biāo)記的優(yōu)點(diǎn),即位點(diǎn)數(shù)量無限,呈典型的孟德爾遺傳,無表型、復(fù)等位效應(yīng),不受環(huán)境影響等,還具有一些獨(dú)特的優(yōu)越性,如標(biāo)記異常豐富,典型的AFLP反應(yīng)中,1次電泳可得到100~150個擴(kuò)增產(chǎn)物,其他標(biāo)記技術(shù)難以達(dá)到。穩(wěn)定性、重復(fù)性好,應(yīng)用非常廣泛,可用于任何生物基因組的遺傳分析。與PCR技術(shù)結(jié)合,可在短時間內(nèi)得到大量多態(tài)性標(biāo)記。同時對模板濃度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在對番茄基因組AFLP分析時,證實(shí)了模板濃度在相差1 000倍以內(nèi)(0.000 5~25ng)獲得的指紋圖譜基本一致。另外,在AFLP中標(biāo)記的引物會全部耗盡,引物耗盡后,擴(kuò)增的帶型不受循環(huán)數(shù)的影響。這樣模板濃度即使不一致也可以通過增減循環(huán)次數(shù)的方法獲得強(qiáng)度一致的帶型。目前,AFLP是構(gòu)建基因組特定區(qū)段高密度連鎖圖譜的最有效的方法。此外,AFLP全基因組分布非常適合構(gòu)建遺傳連鎖圖譜。AFLP也可以用于檢測DNA庫(DNA pool)克隆的DNA大片段的多態(tài)性,而且其多態(tài)性的標(biāo)記大多對應(yīng)于基因組的某一位置,這樣就可以和STS一樣,成為遺傳圖譜(genetic map)和物理圖譜(physical map)之間的橋梁[25,26]。

實(shí)際操作中,影響AFLP指紋圖譜結(jié)果的因素很多。因此,應(yīng)采取質(zhì)量高、純度好、分子量大的的基因組DNA作為模板。如果模板中含有其他雜質(zhì)或者DNA降解很嚴(yán)重,導(dǎo)致酶切不完全,許多未經(jīng)酶切的模板片段經(jīng)電泳后產(chǎn)生表現(xiàn)為高分子量的條帶(假帶),導(dǎo)致不能真實(shí)地反映被測物種的多態(tài)性。為了避免電泳的條帶過多或者過少,應(yīng)對PCR反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化,篩選出最佳的引物組合。PCR擴(kuò)增時,應(yīng)在模板變性之前加入Tag酶和dNTP,否則會導(dǎo)致擴(kuò)增失敗。反應(yīng)體系中的dNTP濃度不能過低,否則擴(kuò)增產(chǎn)物容易形成雙鏈結(jié)構(gòu)[21,27]。

2.6序列標(biāo)簽位點(diǎn)(STS)

序列標(biāo)簽位點(diǎn)(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能夠在基因組中作為“路標(biāo)”使用的DNA序列,是對由特定引物序列所界定的一類DNA標(biāo)記的統(tǒng)稱。其最大特點(diǎn)就是利用特異PCR,因此結(jié)果非常可靠。顯然,成為STS必須滿足2個條件:①序列已知;②位置確定并唯一。從理論上講,任何一段DNA都可以成為STS。但是,由于需要的是與某一個目標(biāo)性狀基因或已知的標(biāo)記緊密連鎖的DN段,因此能夠利用的STS數(shù)量則非常有限。根據(jù)單拷貝的DN段兩端的序列設(shè)計(jì)1對特異引物擴(kuò)增基因組DNA,產(chǎn)生的一段長度為幾百bp的特異序列在基因組中往往只出現(xiàn)1次,從而能夠界定基因組的特異位點(diǎn)。在人類基因組作圖中已用其作為將遺傳圖譜與物理圖譜整合的共同位標(biāo),這在基因組作圖上具有非常重要的作用。隨著大量的模式生物的全基因組測序,會有越來越多的可利用的STS被發(fā)現(xiàn)。

2.6.1表達(dá)序列標(biāo)簽標(biāo)記(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常長度300~500bp)單次重復(fù)的mRNA序列或cDNA序列。它們在特定的組織或者特定的時期內(nèi)特異的表達(dá),可以看作是特定的cDNA文庫中的標(biāo)記。EST計(jì)劃由美國科學(xué)家Venter于1989年提出,并首先應(yīng)用于人類基因組研究,之后被廣泛用于植物基因組研究,它是通過大規(guī)模的cDNA隨機(jī)測序,從而獲得對基因組認(rèn)識的一種研究策略。目前,許多國家和組織正在開展某些作物基因組EST計(jì)劃的研究,如成立于1998年的國際小麥族EST協(xié)作網(wǎng)(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麥類EST研究和開發(fā)的[28]。近幾年來,國際公共數(shù)據(jù)庫中的EST序列呈指數(shù)增長,截止到2006年8月,美國生物信息中心(NCBI)數(shù)據(jù)庫Genbank已公布涉及205 000種生物的61 132 599條EST序列,總長度共65 369 091 950bp。

快速增長的ESTs數(shù)據(jù)為SSR標(biāo)記的開發(fā)提供了一個巨大的有價值的來源。首先,避免了傳統(tǒng)SSR標(biāo)記開發(fā)需要構(gòu)建基因組DNA文庫等煩瑣步驟,而且從ESTs中發(fā)掘出的SSR只是ESTs測序計(jì)劃的副產(chǎn)品,從而節(jié)省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它將為功能基因提供“絕對”的標(biāo)記[30]。同時,由于不同物種間基因共線性和保守性,從一種作物中開發(fā)的EST-SSR可同時用于其他作物研究,從而能夠?yàn)楸容^基因組學(xué)和同源基因克隆提供新的途徑[31]。現(xiàn)在EST-SSR已被用于構(gòu)建遺傳圖譜、分離與鑒定新基因、基因表達(dá)差異研究、比較基因組研究和制備DNA芯片等方面。

另外,還有一種被稱為GSS序列的標(biāo)記。GSS序列本質(zhì)上和EST序列是一樣的,不同之處是它的序列直接來源于基因組而不是mRNA或cDNA。它通常有以下幾種來源:①全基因組檢測得到的特異/單次重復(fù)序列;②來自質(zhì)粒/BAC/YAC克隆所得到的單次重復(fù)序列;③基因組外顯子捕獲;④通過Alu―PCR得到的序列。

2.6.2微衛(wèi)星(SSR)。微衛(wèi)星(microsatellite)又叫做簡單重復(fù)序列(Simple Sequence Repeat)或者短串聯(lián)重復(fù)序列(Short trandem repeat,STR)、簡單序列長度多態(tài)性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。簡單序列重復(fù)多態(tài)性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微衛(wèi)星指的是真核生物普遍存在的遍布整個基因組的排列為2~5個核苷酸的短串聯(lián)重復(fù)序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重復(fù)序列最為常見,其長度由重復(fù)單位的拷貝數(shù)決定。在真核生物基因組中微衛(wèi)星很豐富,通常長度能夠達(dá)到150bp,是一類呈高度多態(tài)的遺傳標(biāo)記,不僅可用于基因組遺傳連鎖圖的構(gòu)建以及基因的定位與克隆,而且可用于遺傳性疾病的連鎖分析和基因診斷。其重復(fù)單位數(shù)目的改變可以引起相當(dāng)高的多態(tài)性,但突變率僅為0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以穩(wěn)定地遺傳,是一種很好的遺傳標(biāo)志[32]。

微衛(wèi)星約占真核基因組的5%,其基本構(gòu)成單位一般為1~8bp,多位于編碼區(qū)附近,也可位于內(nèi)含子、啟動子及Alu序列(反向重復(fù)序列)中。人類基因組約有5~10萬個(CA)n重復(fù)序列。通常認(rèn)為重復(fù)序列的產(chǎn)生是由于在遺傳物質(zhì)復(fù)制過程中DNA滑動或在有絲分裂、減數(shù)分裂期染色體不對等交換所致,因此該重復(fù)序列多存在于不經(jīng)嚴(yán)格選擇的基因組區(qū)域。目前普遍認(rèn)為微衛(wèi)星充當(dāng)基因重組的熱點(diǎn)是基因重排和變異的來源[33]。微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于復(fù)制錯誤(replication error,RER)引起的簡單重復(fù)序列的增加或丟失,也稱RER陽性或RER表型。MSI首先在結(jié)直腸癌中觀察到。微衛(wèi)星通過改變DNA結(jié)構(gòu)或通過與特異性蛋白質(zhì)結(jié)合而發(fā)揮其基因調(diào)控作用。

由于微衛(wèi)星的寡核苷酸在同一物種的不同基因型之間差異很大,可以利用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。引物根據(jù)與微衛(wèi)星重復(fù)序列兩翼的特定保守序列設(shè)計(jì),用來擴(kuò)增重復(fù)序列本身。由于重復(fù)的長度變化極大,所以這是檢測多態(tài)性的1種有效方法[34]。其特點(diǎn)包括:一般檢測到的是1個單一的多等位基因位點(diǎn);共顯性遺傳,故可鑒別雜合子和純合子;得到的結(jié)果復(fù)性很高。為了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝膠電泳,它可檢測出單拷貝差異。也可以在同1個反應(yīng)試管中把PCR反應(yīng)與不同的SSR引物結(jié)合起來(稱為multiplexing),這可節(jié)省時間,但是,這只能在不同引物的產(chǎn)物在大小上下不重疊的情況下才能使用[35,36]。很顯然,使用SSR技術(shù)的前提是需要知道重復(fù)序列兩翼的DNA序列的信息,這一方面可以在其他種的DNA數(shù)據(jù)庫中查詢,否則就必須先建立含有微衛(wèi)星的基因組文庫,再從中篩選可用的克隆,進(jìn)行測序,然后設(shè)計(jì)合適的引物。同時,這種由保守序定的微衛(wèi)星序列也具有染色點(diǎn)的特異性,因此1981年Miesfeld等首次發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星后,很快成為1種常用高效的分子標(biāo)記。統(tǒng)計(jì)分析表明,不同的物種其微衛(wèi)星的突變頻率也是穩(wěn)定的。SSR的PCR引物也是對某一高變重復(fù)位點(diǎn)高度專一的。用特定引物擴(kuò)增出相應(yīng)的微衛(wèi)星片段后,再通過電泳分離,差異可經(jīng)過EB或者銀染后觀察。一般種群可顯示出超過10種類型的等位基因。微衛(wèi)星不僅重復(fù)單位變異數(shù)大,而且其重復(fù)區(qū)域總長度又在PCR易于擴(kuò)增的區(qū)域,快速簡便,所需的DNA用量小。與等位酶相似,微衛(wèi)星是具有獨(dú)立的共顯性基因。由于微衛(wèi)星的遺傳中性并且比等位酶法有更多的可供檢測的等位基因,這樣就可以提供更加精細(xì)的基因變化的范圍,因此在種群研究上有著更大的應(yīng)用[3,34,37-39]。

簡而言之,微衛(wèi)星的最大優(yōu)點(diǎn)在于通過簡單的PCR擴(kuò)增即可直接檢測到已知的特定的染色點(diǎn),不僅具有一般PCR操作簡單、快速、成本低的特點(diǎn),還具有RFLP的穩(wěn)定可靠、特異性、共顯性等特點(diǎn),不足之處是其引物開發(fā)難度較大,技術(shù)復(fù)雜,周期長,成本也高。不過隨著眾多模式生物的全基因組測序的飛速進(jìn)展,對全基因組了解的日益全面,各個大型數(shù)據(jù)庫的逐步完善,并且借助越來越發(fā)達(dá)的計(jì)算機(jī)計(jì)算和預(yù)測技術(shù),使得開發(fā)成本有所降低。

2.6.3其他具有特定引物的分子標(biāo)記種類。

(1)加錨微衛(wèi)星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)對SSR技術(shù)進(jìn)行了發(fā)展[40],他們用加錨微衛(wèi)星寡核苷酸作引物,對基因組節(jié)段而不是重復(fù)序列本身進(jìn)行擴(kuò)增。在SSR的5′端或3′端加上2~4個隨機(jī)選擇的核苷酸,這可引起特定位點(diǎn)退火。這樣就能導(dǎo)致位于反向排列的間隔不太大的重復(fù)序列間的基因組節(jié)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增。這類標(biāo)記又被稱為ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。這類標(biāo)記往往是顯性遺傳的。在所用的兩翼引物中,可以1個是ASSR引物,另1個是隨機(jī)引物。如果1個是5′端加錨的ASSR引物,另1個是隨機(jī)引物,則被稱為RAMP技術(shù)。

(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技術(shù)又可稱為PCR-RFLP。所用的PCR引物是針對特定的位點(diǎn)而設(shè)計(jì)的。其基本步驟是:先進(jìn)行PCR擴(kuò)增,然后將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用限制性內(nèi)切酶酶切,再用瓊脂糖凝膠電泳將DN段分開,用EB染色,觀察。與RFLP技術(shù)一樣,CAPS技術(shù)檢測的多態(tài)性其實(shí)是酶切片段大小的差異。在酶切前進(jìn)行RCR產(chǎn)物檢測,其多態(tài)性稱為ALP。Neff et al.(1998)在此基礎(chǔ)上又發(fā)展出dCAPS技術(shù)(derived CAPS),這是檢測單核苷酸多態(tài)性的一種良好方法。

(3)單引物擴(kuò)增反應(yīng)(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技術(shù)與RAPD技術(shù)相似的是也只用1個引物,但SPAR分析中所用的引物不是隨機(jī)的,而是在SSR的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。擴(kuò)增的是SSR之間的DNA序列。又稱為MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。

(4)小衛(wèi)星區(qū)域DNA直接擴(kuò)增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小衛(wèi)星的核心序列作引物進(jìn)行擴(kuò)增。

(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。與SPAR技術(shù)相近,也只用1個引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重復(fù)序列)的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的,擴(kuò)增的是copia(另一種反向重復(fù)序列)序列之間的DNA序列。

(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。這種技術(shù)與SPAR技術(shù)也相近,所用的引物是在copia序列的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)的,擴(kuò)增的是copia序列之間的DNA序列。

(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。檢測的對象是內(nèi)含子的長度差異。根據(jù)內(nèi)含子兩端的特征序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出長度不同的內(nèi)含子片段。

(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名與RAMP的英文全名相近,但實(shí)驗(yàn)方法卻不同。RAMPO的基本步驟是:先用1個單一的隨機(jī)引物(即RAPD引物)對基因組DNA擴(kuò)增,用電泳將擴(kuò)增片段分開,然后,把凝膠轉(zhuǎn)移到尼龍膜上,使之與一個帶有放射性標(biāo)記(或其他標(biāo)記)的與SSR互補(bǔ)的寡核苷酸探針如(CA)8和(GA)8雜交,放射自顯影后可得到新的多態(tài)性類型。

先找到RFLP標(biāo)記后,對RFLP探針進(jìn)行測序,再合成適當(dāng)?shù)腜CR引物,這樣可發(fā)現(xiàn)新的STS標(biāo)記。這也可稱為RFLP-PCR。

3抗性基因同源序列(RGA)

近年來,在各種農(nóng)作物抗性育種的進(jìn)程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、馬鈴薯、煙草、擬南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物對病毒、細(xì)菌、線蟲的抗性基因。例如煙草抗花葉病毒基因、水稻抗白葉枯病基因Xa-21、擬南芥抗丁香假單胞桿菌基因RPS2、亞麻抗銹病基因L6以及甘蔗抗胞囊線蟲基因HS1等。

Leister等通過分析研究已克隆的植物抗病基因的結(jié)構(gòu)特征,發(fā)現(xiàn)很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美國科學(xué)院院刊》在同一期發(fā)表了2篇應(yīng)用同源序列從大豆中克隆R基因同源序列的報(bào)道,從而引發(fā)了同源序列法在植物抗病基因研究中的應(yīng)用。隨后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多種類型的保守結(jié)構(gòu)域。Hammond Kosack和Parker通過分析已克隆的植物抗病基因結(jié)構(gòu),將植物抗病基因分為8 類,其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重復(fù)子Leucine-rich Repeats,LRR)結(jié)構(gòu)域的抗病基因是最主要的類型。

這些結(jié)構(gòu)可能是參與蛋白質(zhì)之間的相互作用或者細(xì)胞信號的傳導(dǎo)以及識別。根據(jù)抗性基因的這一共性,以其保守結(jié)構(gòu)的序列為基礎(chǔ)設(shè)計(jì)引物,在任何作物中,用PCR技術(shù)擴(kuò)增和分離具有相似序列的DN段,即抗性基因同源序列。

RGA提供了一種快速鑒定候選抗性基因的便捷途徑。目前已經(jīng)利用此技術(shù)在小麥、大豆、馬鈴薯中鑒定了候選抗性基因,它們在基因組的位置基本上就在已知的抗病基因區(qū)域。已知基因包括抗病毒、細(xì)菌、真菌和線蟲的基因。而且部分與抗性基因緊密連鎖的標(biāo)記本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,應(yīng)用RGA進(jìn)行基因定位可以較快地檢測到與抗性基因緊密連鎖的分子標(biāo)記。可以預(yù)見,RGA將成為抗性基因定位的重要手段,并且在分子作圖的領(lǐng)域?qū)l(fā)揮更加巨大的作用[41,42]。

4單核苷酸多態(tài)性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)

單核苷酸多態(tài)性是指2套基因組的DNA序列兩兩進(jìn)行位置比對時, 單個核苷酸的的不同而顯示出的差異(多態(tài)性)。因此,SNP反映了過去多數(shù)突變事件的特點(diǎn),2個個體在同一位點(diǎn)攜帶的不同等位基因被認(rèn)為是進(jìn)化的遺傳標(biāo)志。顯而易見,SNP是目前已知的多態(tài)性最高的分子標(biāo)記。據(jù)Genbank估計(jì),如果比較2套人類基因組的DNA序列,出現(xiàn)SNP的頻率可達(dá)1/2 000~1/1 000,看起來這個頻率并不高,但是考慮到人類基因組共有3.2×109bp時,即可能出現(xiàn)3.2×1012個SNP位點(diǎn)時,這個數(shù)量已經(jīng)相當(dāng)可觀了。并且這只是2套基因組之間的比較,所有的SNP位點(diǎn)肯定比這個數(shù)字大得多。水稻中SNP分布頻率也很高,平均1 000bp就有1個SNP,這些標(biāo)記隨著水稻基因組的實(shí)施而被發(fā)現(xiàn)和利用。由于SNP具有同一個位點(diǎn)多態(tài)性低而全基因組多態(tài)性又極其豐富的特點(diǎn),并且分析時只需要進(jìn)行陰/陽性分析而不需進(jìn)行片段的長度分析,特別適合用DNA芯片技術(shù)進(jìn)行大規(guī)模的掃描分析,是繼微衛(wèi)星后最為高效的標(biāo)記。不過其昂貴的成本(開發(fā)和使用的成本都很高)使其應(yīng)用受到一定的限制。建立可供利用的SNP標(biāo)記需經(jīng)過以下幾步:①全基因組測序;②根據(jù)測序結(jié)果確定特定的序列標(biāo)記位點(diǎn);③對STS進(jìn)行掃描,尋找SNP位點(diǎn);④確定SNP;⑤將SNP定位到染色體上。

5單鏈構(gòu)象多態(tài)性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)

SSCP是指DNA單鏈構(gòu)象的多態(tài)性,是基于PCR擴(kuò)增而新發(fā)展起來的一項(xiàng)檢測DNA多態(tài)性的分析技術(shù)。在進(jìn)行SSCP分析時,利用PCR特異的擴(kuò)增出基因組目的DN段,然后將這些擴(kuò)增出來的DN段進(jìn)行變性處理,使雙鏈DNA分開成單鏈,再用非變性凝膠電泳分離。由于在自然狀態(tài)下,單鏈DNA會折疊卷曲,形成一定點(diǎn)空間構(gòu)象,這種空間構(gòu)象是由DNA鏈的堿基序列決定。如果擴(kuò)增的目的DN段序列的堿基發(fā)生了變異,就可能造成其單鏈的空間構(gòu)象發(fā)生改變,從而影響其單鏈電泳時的遷移速率,導(dǎo)致其在電泳圖譜上的帶紋位置不同,顯示出不同生物個體DNA的特異性。

6新型分子標(biāo)記的開發(fā)及其應(yīng)用前景

自從20世紀(jì)70年代第1代分子(RFLP)標(biāo)記出現(xiàn)以來,分子標(biāo)記家族迅速發(fā)展繁榮起來,并且準(zhǔn)確性和靈敏性也一步步提高。目前的SNP技術(shù)已經(jīng)可以在單個核苷酸的水平上找出不同樣本之間的差異,即使它們之間的親緣關(guān)系非常接近。

縱觀分子標(biāo)記的發(fā)展,是伴隨著人們對生命本質(zhì)的認(rèn)識一步步加深,認(rèn)識范圍從宏觀表型一步步逼近微觀世界的進(jìn)程同步發(fā)展的。任何一個特殊生命現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),都可能導(dǎo)致革命性的理論或技術(shù)的產(chǎn)生,DNA雙螺旋理論的提出導(dǎo)致了DNA的自我復(fù)制理論,又進(jìn)而導(dǎo)致了PCR技術(shù)以至于后來的全自動PCR儀的問世(當(dāng)然也少不了其間Taq聚合酶的發(fā)現(xiàn))。比如各種類型的外切酶和內(nèi)切酶的發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致了RFLP技術(shù)的產(chǎn)生。

重大的技術(shù)突破來源于理論的突破性進(jìn)展,重大理論的提出來源于無數(shù)細(xì)微現(xiàn)象的總結(jié)。回顧20世紀(jì)生命科學(xué)的重大突破:1900年孟德爾的遺傳理論被重新認(rèn)識;1920年,摩爾根的基因理論和連鎖遺傳的提出;1953年,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)理論的提出;直到90年代,自動PCR儀的出現(xiàn)。從此,人們又進(jìn)入了一個眾多實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象的重復(fù)和積累的階段。已經(jīng)有很多不能解釋甚至是矛盾的試驗(yàn)現(xiàn)象在陸續(xù)出現(xiàn)。可以預(yù)言,下一次的理論突破將導(dǎo)致更加革命性的發(fā)現(xiàn),也必將使得分子標(biāo)記技術(shù)能夠從更加深的層面上解釋生命現(xiàn)象本身,人們對分子標(biāo)記的認(rèn)識和利用也更加深刻和簡便。并且隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)的迅速發(fā)展,使得人們不僅能從浩如煙海的數(shù)據(jù)和現(xiàn)象中發(fā)現(xiàn)總結(jié)規(guī)律,還能夠根據(jù)現(xiàn)有的現(xiàn)象和規(guī)律來預(yù)測可能的現(xiàn)象乃至規(guī)律。根據(jù)目前的發(fā)展來看,分子標(biāo)記的用途不會再局限在傳統(tǒng)的生物、醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域,還會擴(kuò)大到諸如數(shù)據(jù)加密傳輸、計(jì)算技術(shù)等領(lǐng)域。

7參考文獻(xiàn)

[1] 黎裕,賈繼增,王天宇,等.分子標(biāo)記的種類及其發(fā)展[J].生物技術(shù)通報(bào),1999(4):19-22.

[2] 鄭康樂,黃寧.標(biāo)記輔助選擇在水稻改良中的應(yīng)用前景[J].遺傳,1997, 19(2):40-44.

[3] 樊葉揚(yáng),莊杰云,吳建利,等.應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別水稻秈粳亞種[J].遺傳,2000,22(6):392-394.

[4] 賈繼增.分子標(biāo)記種質(zhì)資源鑒定和分子標(biāo)記育種[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),1996,29(4):1-10.

[5] TANKSLEY S D,YOUNG N D,PATERSON A H. RFLP mapping in plant breeding: new tools for an old science[J].Biotechnology,1989(7):257-264.

[6] HUANG N.pyramiding of bacterial blight resistance genes in rice:maker-aid selection using RFLP and PCR[J].Theor Appl. Genet,1997(95):313-320.

[7] 張漢堯.RFLP在植物遺傳育種研究中的應(yīng)用[J].西南林學(xué)院學(xué)報(bào),2006, 26(l):75-80.

[8] 劉春林,官春云,李木旬.植物RAPD標(biāo)記的可靠性研究[J].生物技術(shù)通報(bào),1999,15(2):31-34.

[9] 錢惠榮,鄭康樂.DNA標(biāo)記和分子育種[J].生物工程進(jìn)展,1998,18(3):12-18.

[10] WILLIAMS J K G,HANAFEY M K,RAFALSKI J A,et al.Genetic analysis using random amplified polymorphisms DNA markers[J]. Meth-ods in Enzymology,1993(218):704-740.

[11] 方宣鈞,劉思衡,江樹業(yè).品種純度和真?zhèn)蔚姆肿訕?biāo)記鑒定及其應(yīng)用[J].農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào),2000,8(2):106-110.

[12] 湯復(fù)躍,周立人.RAPD和RFLP在大豆研究中的有關(guān)進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2006,12(6):52-53.

[13] D ZAMIR,S TANKSLEY. A advanced backcross QTL analysis of to-mato[J]. Theor Appl Genet,1998(97):170-180.

[14] 倪新強(qiáng),王忠華,夏英武.分子標(biāo)記輔助選擇及其在水稻育種中的應(yīng)用[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào),2001,17(3):58-61.

[15] 羅素蘭,賀普超,周鵬,等.與葡萄抗霜霉病基因緊密連鎖的分子遺傳標(biāo)記[J].遺傳學(xué)報(bào),2001,28(1):76-82.

[16] 田義軻,王彩虹,戴洪義,等.與蘋果Co基因緊密連鎖的RAPD標(biāo)記的篩選及其SCAR標(biāo)記轉(zhuǎn)換[J].遺傳學(xué)報(bào),2004,31(9):919-925.

[17] 劉俊峰,張國珍,馬秋娟,等.一個與稻瘟病菌無毒基因AVR-Pik連鎖的SCAR標(biāo)記的分離[J].植物病理學(xué)報(bào),2003,33(2):151-155.

[18] LI YU,JIA JI-ZENG,WANG TIAN-YU.Types of molecular markers and their development[J].Biotechnology Information,1999(4):19-22.

[19] WELSH J,MCCLELLAND M.Fingerprinting genomes using PCR with arbicary primers[J].Nucl Adics Res,1990(18):7213-7218.

[20] ZABEAN M,VOS P.Selective reseriction fragment amplification:a ge-neral method for DNA fingerping. Euro pean patent Application 9240-2629[D],1993-03-31.

[21] 王斌,翁曼麗.AFLP的原理及其應(yīng)用[J].雜交水稻,2003(5):27-30.

[22] VOS P,HOGERS.R,BLEEKER M,et al. AFLP:a new technique for DNA fingerprinting[J].Nucleic Acids Research,1995(23):4407-4414.

[23] 李珊,趙桂仿.AFLP分子標(biāo)記及其應(yīng)用[J].西北植物學(xué)報(bào),2003,23(5):830-836.

[24] POWELL W,MOGANTE M,ANDRE C,et a1.The comparison of RFLP、RAPD、AFLP and SSR(microsatellite)Markers for germplasm analysis[J].Molecular Breeding,1996,2(3):225-238.

[25] 熊立仲,王石平,劉克德,等.微衛(wèi)星DNA和AFLP標(biāo)記在水稻分子標(biāo)記連鎖圖上的分布[J].植物學(xué)報(bào),1998,40(7):605-614.

[26] 繆穎.AFLP分子標(biāo)記及其應(yīng)用[J].亞熱帶植物通訊,1999,28(2):55-60.

[27] 鄭先云,郭豆平,馬恩波,等.AFLP分子標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展[J].生命的化學(xué),2003,23(1):65-67.

[28] 駱蒙,賈繼增.國際麥類基因組EST計(jì)劃研究進(jìn)展[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2000,33(6):l10-l12.

[29] 李永強(qiáng).基于表達(dá)序列標(biāo)簽的微衛(wèi)星標(biāo)記EST―SSR研究進(jìn)展[J].植物遺傳資源學(xué)報(bào),2004,5(1):91-95.

[30] ADAMS M D,KELLEY J M,GOCAYNE J D,et plementary DNA sequencing:expressed sequence tags and human genome project[J].Science,1991,252(5013):1651-1656.

[31] SCOTT K V,EGGLER P,SEATON G,et al.Analysis of SSRs derived from grape ESTs[J].Theor Appl Genet,2000(100):723-726.

[32] 何平.真核生物中的微衛(wèi)星及其應(yīng)用[J].遺傳,1998,20(4):42-47.

[33] 朱振東,賈繼增.小麥SSR標(biāo)記的發(fā)展及應(yīng)用[J].遺傳,2003,25(3):355-360.

[34] 李云海.用微衛(wèi)星DNA標(biāo)記檢測中國主要雜交水稻親本的遺傳差異[J].植物學(xué)報(bào),1999,41(10):1061-1066.

[35] 李晶,何平,李仕貴,等.利用微衛(wèi)星標(biāo)記鑒定雜交水稻岡優(yōu)22種子純度的研究[J].生物工程學(xué)報(bào),2000,16(2):211-214.

[36] 李曉輝,李新海,李文華,等.SSR標(biāo)記技術(shù)在玉米雜交種種子純度測定中的應(yīng)用[J].作物學(xué)報(bào),2003,29(1):63-68.

[37] 朱作峰.用SSR標(biāo)記比較亞洲栽培稻與普通野生稻的遺傳多樣性[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(12):1437-1441.

[38] 趙勇,楊凱,Akbar arc cheema,等.利用水稻功能基因SSR標(biāo)記鑒定水稻種質(zhì)資源[J].中國農(nóng)業(yè)科學(xué),2002,35(4):349-353.

[39] 劉殊,程慧,王飛,等.我國雜交水稻主要恢復(fù)系的DNA多態(tài)性研究[J].中國水稻科學(xué),2002,16(1):1-5.

[40] ZIETKIEWICZ E,YOTOVA V,JARNIK M,et al. Nuclear DNA diversity in worldwide distributed human populations[J].Gene,1997,(205):161-171.

遺傳學(xué)重疊效應(yīng)范文5

關(guān)鍵詞：抑郁癥；神經(jīng)成像；轉(zhuǎn)化研究；臨床

分類號：B845

1.前言

抑郁癥（Maior Depressive Disorder）是最常見的精神障礙之一，其在臨床上最為顯著的表現(xiàn)為情緒低落、精力減退、活動降低、缺乏以及相關(guān)的軀體癥狀（如體重增加或減輕、睡眠障礙和疲勞等），重度抑郁甚至導(dǎo)致心理遲滯與思維困難（Seminowiez et al.，2004）。世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，抑郁癥目前已經(jīng)成為全球第四大疾患，并且預(yù)計(jì)到2020年可能成為僅次于心臟病的人類第二大疾患（WHO，2008）。相關(guān)數(shù)據(jù)表明，高達(dá)20%的人群在其人生歷程中至少經(jīng)歷過一次抑郁，而且其復(fù)發(fā)率超過80%（Gotlib&Hamilton，2008）。抑郁癥不但增加了病人及其家屬的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，損害了病人的生理、認(rèn)知和社會功能，還導(dǎo)致了更高的死亡風(fēng)險（Bortolotti，Menchetti，Bellini，Montaguti，&Berardi，2008）。由于它的高發(fā)生率和破壞性后果，抑郁癥已經(jīng)成為一種重要的公共健康問題。

雖然許多元分析的結(jié)果表明，心理治療（如認(rèn)知行為療法、心理動力學(xué)療法與人際關(guān)系療法等）和藥物治療能夠減輕抑郁癥狀，有一定治療效果（cuijpers，van Straten，Andersson，&Varl Oppen，2008；Cuijpers，Van Straten，van Oppen，&Andersson，2008；Pinquart，Duberstein，&Lyness，2008）。但在臨床隋境中，還存在以下問題：（1）抑郁癥的病因和發(fā)病機(jī)制不甚清楚。（2）現(xiàn)有的診斷采用疾病分類學(xué)的方法，過于簡單和主觀，容易導(dǎo)致較低的抑郁癥識別率。（3）抑郁癥具有很大的異質(zhì)性，不同階段和不同的人表現(xiàn)出來的癥狀類型和嚴(yán)重程度存在很大差異，容易導(dǎo)致較高的誤診率。（4）抑郁癥治愈率低且藥物治療存在一定副作用，尤其是針對難治型抑郁癥（treatment-resistant refractory maior depression），大約20%的人治療不起作用（Fava，2003；Keller et al.，1992）。（5）抑郁癥治療的長期效果差，復(fù)發(fā)率高。基于以上因素，探討新的途徑，用于提高抑郁癥的預(yù)防、診斷和治療效果具有重要的現(xiàn)實(shí)價值。而神經(jīng)成像技術(shù)的轉(zhuǎn)化研究為這一目標(biāo)的實(shí)現(xiàn)提供了巨大的可能性。

2.轉(zhuǎn)化研究的發(fā)展概況、定義及其主要步驟

轉(zhuǎn)化研究（translational research）是指系統(tǒng)性地嘗試整合基礎(chǔ)研究者和臨床研究者的兩個不同的研究視角（Rosenthal，Gratz，Kosson，Cheavens，Lejuez，&Lynch，2008）。其中基礎(chǔ)研究經(jīng)常采用控制精良的實(shí)驗(yàn)室方法來闡述潛在的過程，在該過程中不需要思考實(shí)際應(yīng)用目標(biāo)，其產(chǎn)出是一般知識以及對自然法則和規(guī)律的理解（Rubio et al.，2010）；而臨床研究者聚焦于將研究結(jié)果更加直接地運(yùn)用到真實(shí)世界中，包括患者導(dǎo)向研究（Patient-oriented research）、流行病學(xué)和行為研究以及成果研究和健康服務(wù)研究（NIH，2001）。轉(zhuǎn)化研究這一術(shù)語最早出現(xiàn)在1993年Medline搜索中，但是上世紀(jì)90年代的醫(yī)學(xué)文獻(xiàn)中只有很少的文章與該術(shù)語相關(guān)聯(lián)，而且相關(guān)的文章也大都是關(guān)于癌癥研究的。那時，關(guān)于癌癥的文獻(xiàn)傾向使用“轉(zhuǎn)化研究”來指代包含不同類型研究的工作（例如，覆蓋基礎(chǔ)和臨床研究兩方面的免疫學(xué)研究）或者在某一特殊研究類型中包含不同學(xué)科的工作（例如，涉及分子遺傳學(xué)和免疫學(xué)兩種學(xué)科的基礎(chǔ)研究）（Rubio et al.，2010）。時至今日，不同領(lǐng)域的研究者在此定義上進(jìn)行了大量嘗試和工作。大體上說，目前轉(zhuǎn)化研究主要有兩種路徑：一種是將基礎(chǔ)研究的發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化到臨床運(yùn)用（from bench to bedside）；另一種是將臨床問題轉(zhuǎn)化為基礎(chǔ)研究（fTom bedside to bench）（Rubio et al.，2010）。

Wang，Heinssen，Oliveri，Wagner和Goodman（2009）提出轉(zhuǎn)化研究包含兩個步驟：第一步是將實(shí)驗(yàn)室和前臨床研究階段所得的研究結(jié)果應(yīng)用于人類的臨床試驗(yàn)或研究；第二步著眼于將臨床試驗(yàn)或研究的結(jié)果遷移到日常生活中去，以提高人類健康水平。在此過程中預(yù)防和治療策略的成本效益在轉(zhuǎn)化科學(xué)中也是非常重要的部分。不過上述只是一個單向的轉(zhuǎn)化研究路徑。Rubio等（2010）以提高公共健康為長期目標(biāo)，將基礎(chǔ)研究、患者導(dǎo)向研究和以人群為基礎(chǔ)的研究fPopulafion-based research）相整合，提出了更加詳細(xì)和更為成熟的轉(zhuǎn)化研究多向模式。該模式分為3個步驟：第一步探索基礎(chǔ)研究和患者導(dǎo)向研究之間的作用，以促進(jìn)對疾病科學(xué)性的新理解或改善護(hù)理標(biāo)準(zhǔn)；第二步加強(qiáng)患者導(dǎo)向研究和以人群為基礎(chǔ)的研究兩者之間的作用，以改善患者的治療效果，實(shí)施更好方法促進(jìn)人群的健康狀況；第三步提高基于實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究和以人群為基礎(chǔ)的研究之間的作用，促進(jìn)對人類健康和疾病更加深入的科學(xué)性理解。在基礎(chǔ)研究、患者導(dǎo)向研究和以人群為基礎(chǔ)的研究中，兩兩之間是雙向的關(guān)系并且三者之間彼此動態(tài)地交互作用。廣義上說，患者導(dǎo)向研究和以人群為基礎(chǔ)的研究實(shí)際上落入到更廣泛的臨床研究范圍內(nèi)。患者導(dǎo)向研究包括患者和健康個體的研究，用于理解疾病和健康的機(jī)制，決定治療效果或者提供患者護(hù)理軌跡的決策分析；而以人群為基礎(chǔ)的研究則涉及流行病學(xué)、社會和行為科學(xué)、公共衛(wèi)生、質(zhì)量評估以及成本效益等方面。

總之，轉(zhuǎn)化研究作為一種新的視角，為實(shí)驗(yàn)室的基礎(chǔ)研究成果轉(zhuǎn)化到臨床運(yùn)用提供了一個有前景的框架。本文就以抑郁癥為例，沿著從基礎(chǔ)研究到其預(yù)防、臨床診斷和治療的這一轉(zhuǎn)化研究路徑，詳細(xì)探討抑郁癥神經(jīng)成像轉(zhuǎn)化研究的進(jìn)展。

3.抑郁癥的神經(jīng)成像基礎(chǔ)研究

神經(jīng)成像作為認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)研究最為主要的技術(shù)手段之一，使人類有史以來第一次能直接觀察到大腦的心理過程和認(rèn)知活動，成為近年來國際上該領(lǐng)域研究的趨勢。同樣，這一技術(shù)在抑郁癥領(lǐng)域的研究中也發(fā)揮著越來越重要的作用。借助神經(jīng)成像技術(shù)，研究者能夠探討到抑郁癥患者的異常腦區(qū)，這些腦區(qū)可能在結(jié)構(gòu)或功能上異于正常人。如抑郁癥患者的顳葉（temporal lobes）、海馬、杏仁核、額葉（fontal lobes）、扣帶前回（anterior cingulate cortex）、基底神經(jīng)節(jié)（basal ganglia）和丘腦結(jié)構(gòu)異于正常人。具體表現(xiàn)為，抑郁癥患者具有更小的左側(cè)顳葉容量和海馬容量；與慢性抑郁癥病人和正常人相比，首發(fā)抑郁癥患者的杏仁核灰質(zhì)容量減少；在嚴(yán)重的抑郁癥患者中，整個的前額葉容量和/或眶額葉皮層（orbitofrontal codex，OFC）容量減少；抑郁癥患者的吻側(cè)扣帶皮層（rostral cingulate codex）的灰質(zhì)容量減少，并且這和疾病時程有顯著正相關(guān)；雖然基底神經(jīng)節(jié)的結(jié)構(gòu)和抑郁癥的關(guān)系還不確定，但是在難治型抑郁癥患者中，尾狀核（the caudate nuclea）的灰質(zhì)容量減少，這異于康復(fù)的抑郁癥患者和正常人；抑郁癥患者的丘腦灰質(zhì)容量也減少（Bora，F(xiàn)omito，Pantelis，&Yucel，2012；Hastings，Parsey，Oquendo，Arango，&Mann，2004；Neumeister et al.，2005；Vasic，Waiter，HOse，&Wole 2008；vythilingam et al.，2004）。雖然病人的人口學(xué)特征、所采用的成像技術(shù)、分析方法和臨床因素等可能導(dǎo)致結(jié)果存在變異，但是在抑郁癥患者中存在顯著的杏仁核、基底神經(jīng)節(jié)、海馬、眶額皮層、膝下扣帶皮層（subgenual cingulated cortex，sgACC）和丘腦容量改變。

抑郁癥是一種認(rèn)知和情緒障礙，大量的行為和認(rèn)知任務(wù)表明，抑郁癥和負(fù)性認(rèn)知偏差、學(xué)習(xí)和記憶能力受損、對獎賞的鈍化反應(yīng)、對懲罰的高度敏感以及受損的社會認(rèn)知密切相關(guān)（Mathews&MacLeod，2005；Whitmer，F(xiàn)rank，&Gotlib，2012）。與此相對應(yīng)，抑郁癥患者在加工這些認(rèn)知或社會性任務(wù)時，其大腦的激活模式也往往異于正常人。如Davidson，Pizzagalli，Nitschke和Putnam（2002）認(rèn)為抑郁癥是一種情緒表征和調(diào)節(jié)障礙，與這些功能異常相關(guān)的腦區(qū)包括額葉皮層（prefrontal Cortex）、扣帶前回、海馬和杏仁核。Gotlib和Hamilton（2008）認(rèn)為抑郁癥患者的情緒體驗(yàn)、表達(dá)和調(diào)節(jié)異常與杏仁核、膝下扣帶前回的過度激活以及背外側(cè)前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）激活不足密切相關(guān)。Clark，Chamberlain和Sahakian（2009）列舉了抑郁癥患者常見的四種認(rèn)知異常：執(zhí)行控制、記憶、情感加工和反饋敏感性。這些功能改變所涉及的神經(jīng)回路包括額葉多個區(qū)域、皮層下區(qū)域（紋狀體、丘腦）和顳葉結(jié)構(gòu)（杏仁核、海馬）的交互作用。

總之，抑郁癥的神經(jīng)成像基礎(chǔ)研究表明，抑郁癥患者的一些特定腦區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能都不同于正常人，這尤其表現(xiàn)在杏仁核、丘腦、海馬和額葉皮層等部位。這為理解抑郁癥的病因及其發(fā)病機(jī)制提供了新的證據(jù)。基于這些研究成果，可以為抑郁癥的預(yù)防、診斷和治療的轉(zhuǎn)化研究提供新的視角。

4.神經(jīng)成像研究與抑郁癥預(yù)防

鑒于抑郁癥治療的復(fù)雜性，為了減少抑郁癥的巨大疾病負(fù)擔(dān)，越來越多的研究者認(rèn)為抑郁癥的早期識別和預(yù)防能起到更好的效果（Hetrick et al.，2008）。首先因?yàn)榧词乖诶硐氲臈l件下，現(xiàn)有的藥物和心理治療所減少抑郁癥的疾病負(fù)擔(dān)不超過35%（Andrews&Wilkinson，2002；Andrews，Issakidis，Sanderson，Corry，&Lapsley，2004）。其次因?yàn)橐钟舭Y首發(fā)階段的早期有效干預(yù)能夠減少其復(fù)發(fā)的可能性，后者隨著病程的進(jìn)展，將變得更為頻繁。Harrington和Clarke（1998）研究表明，假如抑郁癥患者能夠早在13歲時被成功治愈，那么其在16歲時患復(fù)發(fā)抑郁癥的風(fēng)險將減少大約10%。

流行病學(xué)的調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，青少年早期是抑郁癥的高發(fā)期，且女性得抑郁癥的概率要顯著高于男性，如美國青少年中15%-20%患有重度抑郁（Lewinsohn&Essau，2002）；而在我國約有42.3%的中學(xué)生存在輕度抑郁（馮正直，張大均，2005）。此外，抑郁癥父母的子代在青少年期患抑郁癥的風(fēng)險是健康父母的子代的3-5倍（Hammen，2009）。尤其是母親抑郁與其女性子代的早發(fā)和更嚴(yán)重的抑郁相關(guān)（Lieb，Isensee，Hoefler，Pfister，&Wittchen，2002）。因此，抑郁癥父母的子代，尤其是抑郁癥母親的女性子代，是抑郁癥的高發(fā)群體，對其大腦結(jié)構(gòu)和功能的神經(jīng)成像研究可以探究抑郁癥的風(fēng)險因素。如Chen，Hamilton和Gotlib（2010）的研究表明抑郁癥患者的女兒比正常人的女兒有更少的雙側(cè)海馬灰質(zhì)密度，并且前者的左側(cè)海馬容量減低。Joormann。Cooney，Henry和Gotlib（2012）通過負(fù)性情緒誘發(fā)和自動情緒調(diào)節(jié)任務(wù)，比較了抑郁癥母親的女兒和正常母親的女兒，發(fā)現(xiàn)前者出現(xiàn)更多的杏仁核和腹外側(cè)前額葉皮層（ventrolateral prefrontal codex）激活；而在自動情緒調(diào)節(jié)過程中，后者出現(xiàn)更大的背外側(cè)前額葉皮層（dorsolateral prefrontal cortex）和背側(cè)前扣帶回皮層（dorsal anterior eingulated codex）激活。Mannie，Harmer，Cowen和Norbury（2010）采用不同認(rèn)知負(fù)荷的口頭工作記憶任務(wù)（1-2-3-back vso-back），對父母患有抑郁癥但其本人沒有抑郁癥病史的年輕人和父母及其本人都沒有抑郁癥的年輕人的比較發(fā)現(xiàn)，雖然兩組的總體認(rèn)知能力是相似的（操作準(zhǔn)確性和反應(yīng)潛伏期沒有顯著差異），但是前者比后者在外側(cè)枕葉皮層（lateral occipital cortex）、顳上皮層（superior temporal cortex）和頂上皮層（superior parietal codex）有更大的激活水平。

抑郁的認(rèn)知理論認(rèn)為負(fù)性的認(rèn)知偏差（如注意偏差、記憶偏差和解釋偏差等）是抑郁癥的認(rèn)知易感性因素（Mathews&MacLeod，2005）。在壓力情境下，認(rèn)知易感性高的個體更容易產(chǎn)生抑郁癥。因此，高認(rèn)知易感性也是抑郁癥的風(fēng)險因素，對其相關(guān)腦機(jī)制的探討可以為抑郁癥的早期預(yù)防提供新的參考。如Zhong等（2011）采用情緒匹配任務(wù)，使用fMRI檢驗(yàn)未服藥的抑郁癥患者、具有認(rèn)知易感性的非抑郁癥被試和沒有抑郁癥的正常被試，發(fā)現(xiàn)與正常被試相比，抑郁癥患者有更強(qiáng)的左側(cè)杏仁核激活和更弱的左側(cè)背外側(cè)前額葉皮層激活水平。相似地，與正常被試相比，高認(rèn)知易感性被試有更高的雙側(cè)杏仁核激活和更低的雙側(cè)背外側(cè)前額葉皮層激活水平。高認(rèn)知易感性被試在腦機(jī)制上可能表現(xiàn)為對情緒刺激的前額葉的減弱反應(yīng)和杏仁核的增強(qiáng)反應(yīng)。

總之，最近對抑郁癥高風(fēng)險人群的神經(jīng)成像研究表明，與健康對照組相比，該群體特定腦區(qū)的結(jié)構(gòu)和功能都存在異常。這些異常出現(xiàn)在抑郁癥發(fā)作之前，可能影響抑郁癥的發(fā)展進(jìn)程。因此，借助這些腦成像的證據(jù)，有助于超越以往的問卷調(diào)查和行為學(xué)指標(biāo)，更加敏感地甄別抑郁癥的高風(fēng)險人群，從而對其進(jìn)行早期有效預(yù)防和干預(yù)，有助于減少其抑郁癥發(fā)作風(fēng)險，將損失降低到最低程度。

5.神經(jīng)成像研究與抑郁癥診斷

當(dāng)前抑郁癥的臨床評估主要采用疾病分類學(xué)的方法，根據(jù)臨床訪談診斷體系（如精神障礙診斷原則和統(tǒng)計(jì)手冊第四版DSM-IV、國際疾病分類第十版ICD-10和中國精神障礙分類與診斷標(biāo)準(zhǔn)第3版CCMD-3），通過病人或其家屬的口頭報(bào)告和臨床醫(yī)生的直接觀察來判斷病人是否具有癥狀以及具有何種癥狀，最終做出是否有抑郁癥的診斷結(jié)果。如根據(jù)DSM-IV，抑郁癥的診斷標(biāo)準(zhǔn)是在連續(xù)兩周的時間里，病人表現(xiàn)出九個癥狀（抑郁心境、興趣或缺乏、體重減輕、失眠、精神運(yùn)動興奮或遲緩、疲勞無精力、無價值或負(fù)罪感、無法思維或集中注意力、反復(fù)出現(xiàn)死或自殺念頭、自殺的企圖或計(jì)劃）中的五個以上。這些癥狀必須是病人以前沒有的或者極輕的。并且抑郁癥的診斷至少包括抑郁心境、興趣或缺乏這兩個癥狀中的一個。根據(jù)這些規(guī)范化的評估體系，可以改善我們對患者的認(rèn)識，對抑郁癥做出相對比較準(zhǔn)確的判斷。但是，由于抑郁癥的癥狀診斷采用全或否的方式、自我報(bào)告和臨床觀察的方法具有較強(qiáng)的主觀性，尤其是抑郁癥作為一種復(fù)雜的精神障礙，在不同人中甚至在同一個人不同時期中都會表現(xiàn)出許多異質(zhì)性的情緒、認(rèn)知和運(yùn)動癥狀，這些因素可能使抑郁癥的診斷出現(xiàn)誤差，需要進(jìn)一步完善。

神經(jīng)成像技術(shù)的發(fā)展，尤其是抑郁癥神經(jīng)成像的基礎(chǔ)研究，為抑郁癥的診斷和鑒別提供了一條非常有價值的發(fā)展路徑。其中，抑郁癥的生物標(biāo)記研究是近年來精神障礙領(lǐng)域的一個研究熱點(diǎn)。當(dāng)前抑郁癥的診斷主要依靠于可操作化的診斷系統(tǒng)，但是抑郁癥具有不同的生理機(jī)制，不同生理因素導(dǎo)致的抑郁癥在臨床癥狀上的表現(xiàn)可能是重疊的，生物標(biāo)記就能很好地應(yīng)對這一難題。因此，借助基礎(chǔ)研究所發(fā)現(xiàn)的抑郁癥的生物標(biāo)記，可能是改善抑郁癥患者準(zhǔn)確識別和識別速度的非常重要的一環(huán)。

5.1抑郁癥診斷的生物標(biāo)記

生物標(biāo)記（biomarker）是一種可以客觀測量和評估的特征，可作為正常生理過程、病理過程或者治療干預(yù)的藥物反映的指標(biāo)（Masdeu，2011）。NIH生物標(biāo)記和替代終點(diǎn)（surrogate endpoint）的工作組認(rèn)為存在3種水平的生物標(biāo)記：0型生物標(biāo)記用于追蹤疾病的自然進(jìn)程；1型生物標(biāo)記用于檢驗(yàn)干預(yù)的效果，連同試驗(yàn)化合物所熟知的作用機(jī)理，但和臨床結(jié)果沒有精確的關(guān)系；替代終點(diǎn)2型生物標(biāo)記用于預(yù)測臨床結(jié)果（Wong，TauscheL&Grtmder，2009）。生物標(biāo)記在疾病診斷上產(chǎn)生價值，需要具備以下幾個條件：第一，在甄別和區(qū)分不同的障礙方面有非常高的敏感性和特異性（>80%）（Ritsner&Gottesman，2009）；第二，為了確保它們可用于日常臨床實(shí)踐，生物標(biāo)記是可再生的、可信的、便宜的、非入侵的和容易獲得的（Ritsner&Gottesman，2009）。由于識別生物標(biāo)記并調(diào)查它們之間的相互作用有助于揭示疾病的病理生理原因，長久來看有助于發(fā)展基于生理而不是行為癥狀導(dǎo)向的疾病分類體系，這可能有助于改善抑郁癥的診斷。

Marquand，Mourao-Miranda，Brammer，Cleare和Fu（2008）對完成口頭工作記憶任務(wù)的被試進(jìn)行fMRI掃描，來探究抑郁癥診斷的生物標(biāo)記。他們發(fā)現(xiàn)，2-back任務(wù)具有最高的準(zhǔn)確率，為68%。由于抑郁癥患者在表情加工上存在問題，F(xiàn)u等（2008）采用對悲傷表情和中性表情的神經(jīng)反應(yīng)來鑒別抑郁癥，其中中等強(qiáng)度悲傷表情的準(zhǔn)確率為74%，高強(qiáng)度悲傷表情的準(zhǔn)確率為76%，中性表情的準(zhǔn)確率為87%。鑒于抑郁癥和早期不良依戀之間的關(guān)系，Zhang，Yaseen，Galynker，Hirsch和winston（2011）采用fMRI，比較抑郁癥患者和正常被試在觀看母親照片、朋友照片和陌生人照片時的腦激活模式，采用主成分回歸方法（a principal component regression method，PCR），發(fā)現(xiàn)BA-32的活動模式能夠識別抑郁癥患者。該方法與BDI-II和臨床精神病訪談的診斷一致性為89%，敏感性為85.7%，特異性為92.8%。一些研究者（Hahn et al.，2011）認(rèn)為由于抑郁癥具有多個癥狀，不同癥狀可能涉及到多種神經(jīng)過程，從而單個生物標(biāo)記（如與單個病理異常過程或癥狀相關(guān)的神經(jīng)反應(yīng)）在預(yù)測復(fù)雜癥狀模式的疾病上是有難度的。因此，他們主張采用合成的生物標(biāo)記來診斷抑郁癥。Hahn等（2011）基于3個任務(wù)（對中性表情、大獎賞和安全線索的反應(yīng)）的全腦神經(jīng)反應(yīng)模式，采用模式再認(rèn)算法（pattern-recognition algorithms），發(fā)現(xiàn)綜合多個生物標(biāo)記的決策樹算法（decision tree algorithm）對抑郁癥的診斷正確率為83%（敏感性為80%，特異性為87%），比僅用單個生物標(biāo)記的準(zhǔn)確率提高了11%。

5.2難治型抑郁癥與非難治型抑郁癥的區(qū)別

盡管抑郁癥治療方法在不斷更新，但是大概15%-30%的抑郁癥病人對治療方法存在排斥，導(dǎo)致巨大的個人、社會和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)（Bedim&Turecki，2007）。其中，當(dāng)至少2種來自不同藥理類別的規(guī)范化抗抑郁藥物對抑郁癥癥狀不能產(chǎn)生顯著的改善時，這種抑郁癥就可以稱為難治型抑郁癥（Berlim&Turecki，2007；Stimpson，Agrawal，&Lewis，2002）。因此，發(fā)展針對這一群體的更有效治療方法需要對其神經(jīng)生物基礎(chǔ)有更深刻的認(rèn)識。

Wu等（2011）采用靜息態(tài)功能成像，根據(jù)區(qū)域同步分析（Regional homogeneity analysis），發(fā)現(xiàn)與正常人和非難治型抑郁癥患者相比，難治型抑郁癥患者有更多腦區(qū)改變的區(qū)域同步。Guo等（2012）也采用了靜息態(tài)功能成像，基于一致性的ReHo（Cohe-ReHo）方法，對比了難治型抑郁癥患者和治療敏感（treatment-sensitive）的抑郁癥患者的大腦結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)小腦部位的更低的ReHo值可以作為區(qū)分前者與后者的標(biāo)記，它具有83%的敏感性和86%的特異性。

5.3雙相障礙與單相抑郁癥的區(qū)別

由于在雙相障礙（Bipolar disorder）中，抑郁癥狀比躁狂癥狀更為普遍，且在雙相障礙和單相抑郁癥中都存在較高的亞臨床躁狂癥狀，從而導(dǎo)致在臨床領(lǐng)域中將60%的雙相障礙診斷為抑郁癥或復(fù)發(fā)性單相障礙，從而耽誤合適的治療，導(dǎo)致許多雙相障礙患者的病情惡化（de Almeida&Phillips，2013）。因此，區(qū)分雙相障礙和單相抑郁癥是一個重要的臨床挑戰(zhàn)。識別雙相障礙的生物標(biāo)記可能有助于區(qū)分雙相障礙和單相抑郁癥，并最終優(yōu)化所有抑郁癥患者的臨床和功能結(jié)果。

Konarski等（2008）綜合比較了單相抑郁癥和雙相障礙的神經(jīng)結(jié)構(gòu)成像，發(fā)現(xiàn)皮層下結(jié)構(gòu)，尤其是紋狀體、杏仁核和海馬可以用來區(qū)分單相抑郁癥和雙相障礙。神經(jīng)成像的研究發(fā)現(xiàn)雙相障礙比單相抑郁癥有更大范圍的白質(zhì)連接異常和白質(zhì)高度濃縮（hyperintensities），韁核容量（habenula volume）減少以及在情緒調(diào)節(jié)和注意控制神經(jīng)環(huán)路上有不同的功能異常模式。從不同的病理生理過程，尤其是情緒調(diào)節(jié)、獎賞和注意的神經(jīng)環(huán)路可以區(qū)分雙相障礙和單相抑郁癥（de Almeida&Phillips，2013）。

Lawrence等（2004）對比了雙相障礙和單相抑郁癥對輕度到重度恐懼、快樂和悲傷表情的功能性成像的神經(jīng)反應(yīng)，發(fā)現(xiàn)與單相抑郁癥患者相比，雙相障礙患者對快樂和悲傷表情有更強(qiáng)的皮層下和腹側(cè)前額葉皮層（ventral prefrontal cortical）激活。De Almeida等（2009）采用兩個事件相關(guān)的范式——分別評定快樂和悲傷表情的情緒強(qiáng)度，通過動態(tài)因果模型檢驗(yàn)雙相障礙和單相抑郁癥在支持情緒調(diào)節(jié)左右腦區(qū)中的杏仁核與眶內(nèi)側(cè)前額葉皮層（orbitomedial prefrontal cortex，OMPFC）的有效連接，發(fā)現(xiàn)在快樂評定任務(wù)中異常的、左側(cè)自上而下眶內(nèi)側(cè)前額葉皮層，杏仁核以及右側(cè)的、自下而上的杏仁核-眶內(nèi)側(cè)前額葉皮層有效連接能夠區(qū)分單相抑郁癥和雙相障礙。

Bertocci等（2012）采用面部表情的n-back任務(wù)，通過高記憶負(fù)荷（2-backl和低記憶負(fù)荷（O-back）條件，檢驗(yàn)她們對情緒性分心物的情緒調(diào)節(jié)的執(zhí)行控制的腦機(jī)制，發(fā)現(xiàn)單相抑郁癥女性組比雙相障礙女性組和正常女性組在高記憶負(fù)荷條件下，中性表情分心物誘發(fā)了更大的雙側(cè)和左側(cè)背側(cè)前中扣帶皮層（dorsal anterior midcingulate cortex，dAMCC）激活水平，且兩個抑郁癥組的雙側(cè)殼核（bilateral putamen）激活水平大于正常組。在快樂表情分心物的高記憶條件下，單相抑郁癥的女性比正常女性誘發(fā)了更大的左側(cè)殼核激活水平。因此，在情緒調(diào)節(jié)的注意控制的神經(jīng)環(huán)路上功能異常，尤其是背側(cè)前中扣帶皮層上的差異，是區(qū)分單相抑郁癥和雙相障礙女性的一個潛在神經(jīng)成像測量指標(biāo)。

6.神經(jīng)成像研究與抑郁癥治療

目前抑郁癥治療主要采用心理和藥物兩方面的治療。在心理治療方面，臨床上更多地使用認(rèn)知行為療法和人際關(guān)系療法。這兩種療法共有3個目標(biāo)：（1）旨在改善抑郁癥患者處理壓力事件的方式和有問題的人際關(guān)系，以此來提高他們問題解決的能力；（2）修正患者關(guān)于他們自己和關(guān)系的角度；（3）嘗試幫助個體調(diào)節(jié)壓力情緒狀態(tài)（Frewen，Dozois，&Lanius，2008）。特別是在心理干預(yù)和神經(jīng)成像技術(shù)相結(jié)合來短期治療重度抑郁癥上已取得令人欣喜的結(jié)果，有研究者利用PET、SPECT技術(shù)發(fā)現(xiàn)進(jìn)行人際關(guān)系療法且從未參與過藥物治療的抑郁癥個體，與治療前相比，其大腦的右側(cè)前額葉、左側(cè)前扣帶回皮層、左側(cè)腦島和左側(cè)顳葉皮層的葡萄糖代謝率降低（Brody et al.，2001），整個治療過程右側(cè)后扣帶回的腦血流量明顯增加（Martin，Martin，Rai，Richardson，&Royall，2001）。同樣，利用認(rèn)知行為療法也發(fā)現(xiàn)治療后抑郁個體大腦代謝活動的變化并且得到明顯改善（Goldapple et al.，2004；Siegle，Carter，&Thase，2006）。此外，最近的一項(xiàng)研究還表明心理動力學(xué)療法對抑郁癥患者進(jìn)行長期干預(yù)取得一定的進(jìn)展，他們發(fā)現(xiàn)患者的前額葉一邊緣系統(tǒng)功能（包括左前海馬、杏仁核、膝下扣帶回和內(nèi)側(cè)前額葉皮層）在治療前有較高程度的激活，而在歷時15個月的治療后激活程度明顯降低，這意味著抑郁癥狀的減輕（Buchheim et al.，2012）。

當(dāng)前的藥物治療主要針對一元胺系統(tǒng)，但是將近1/3的病人在第一次開藥后復(fù)發(fā)，抗抑郁癥藥物見效慢，藥物治療需要至少4到6周時間來甄別藥物治療有效者和無效者。Lisiecka等（2011）基于fMRI技術(shù)并采用兩種常見的抗抑郁癥藥物，即文法拉辛或米爾塔扎平fvenlafaxine或者mirtazapine），對抑郁癥患者進(jìn)行四周的隨機(jī)臨床治療，采用表情匹配任務(wù)，考察在治療前和治療后的眶額葉皮層功能連接，發(fā)現(xiàn)在治療前左側(cè)運(yùn)動區(qū)和眶額葉皮層區(qū)更高的功能連接是治療有效者的特征。而治療無效者的特征是更高的眶額葉皮層和小腦的連接。反應(yīng)的強(qiáng)度與左側(cè)眶額葉皮層、尾狀核、丘腦的功能連接正相關(guān)。文法拉辛和米爾塔扎平治療縱向改變的差異體現(xiàn)在運(yùn)動區(qū)、小腦、扣帶回（cingulate gyms）和角回（angular gyrus）。此外，藥物治療對許多病人會產(chǎn)生很多的副作用并且在長期可能復(fù)發(fā)。因此，對于新的抗抑郁藥物的評估和開發(fā)也是非常重要的。例如，選擇性5-羥色胺再攝取抑制劑（SSRI）治療方法的有效性已遭到質(zhì)疑，McCabe，Mishor，Cowen和Harmer（2010）利用西酞普蘭（citalopram）對患者進(jìn)行短期治療時發(fā)現(xiàn)這種抗抑郁藥能同時降低獎賞或厭惡刺激的神經(jīng)加工，造成抑郁所呈現(xiàn)的動機(jī)降低和缺乏狀態(tài)，也可用來解釋SSRI治療期間患者所表現(xiàn)出的情感遲鈍體驗(yàn)。相反地，去甲腎上腺素再攝取抑制劑瑞波西汀（Reboxetine）的使用能促進(jìn)對獎賞刺激在內(nèi)側(cè)眶額葉皮層（medial orbitofrontal cortex）的激活反應(yīng)。近期的一項(xiàng)研究使用抗抑郁藥依他普倫（Escitalopram）對重抑郁患者進(jìn)行治療，同時利用fMRI考察患者在負(fù)性情緒圖片呈現(xiàn)和預(yù)期過程中的神經(jīng)激活，發(fā)現(xiàn)在治療前當(dāng)患者對負(fù)性圖片有所預(yù)期時，杏仁核有更大的激活，即使沒有預(yù)期線索，當(dāng)患者看到負(fù)性圖片時，前額葉也有明顯的激活；而在治療之后杏仁核和前額葉的激活程度都明顯降低（Rosenblau et al.，2012），說明該藥物能夠改變抑郁癥患者異常的情緒加工的神經(jīng)機(jī)制并使其趨于正常化。當(dāng)然，在迫切需要開發(fā)治療抑郁癥的新藥物的同時也面臨著問題，新的開發(fā)方法的出現(xiàn)很大程度上受前臨床方法的不良預(yù)測效度的影響。缺乏前臨床和臨床方法之間的共同靶點(diǎn)（endpoints）也是開發(fā)新藥物的一個不足。

除此之外，伴隨著神經(jīng)成像技術(shù)的發(fā)展，抑郁癥在神經(jīng)生物標(biāo)記上的發(fā)現(xiàn)有助于深入了解其病因、機(jī)制及制定更合理的治療方法。經(jīng)過抗抑郁治療后，嚴(yán)重的抑郁癥患者在觀看悲傷的情緒圖片時，與治療之前相比，個體表現(xiàn)出在大腦的右側(cè)膝下扣帶回和視覺皮層的反應(yīng)的效應(yīng)值下降，這說明對負(fù)性面孔的反應(yīng)與臨床治療的改善有關(guān)，特別表現(xiàn)在膝下扣帶回這一生物標(biāo)記上（Keedwell et al.，2009）。Pizzagalli（2011）通過元分析發(fā)現(xiàn)吻側(cè)前扣帶皮層（rostral anterior cingulate codex，rACC）在靜息狀態(tài)下活動的增強(qiáng)是非常具有前景的，有助于抑郁癥取得更好療效的預(yù)測指標(biāo)。

7.研究展望

雖然抑郁癥的神經(jīng)成像轉(zhuǎn)化研究有助于早期識別抑郁癥的高危人群（如抑郁父母的青少年子代尤其是抑郁母親的女性子代和高認(rèn)知易感性的群體），提供抑郁癥診斷的有效生物標(biāo)記，進(jìn)一步區(qū)分難治型抑郁癥和非難治型抑郁癥、雙相障礙和單相抑郁癥；并有助于進(jìn)一步評估心理治療和藥物治療的干預(yù)效果和開發(fā)新藥物。但是，還有以下問題有待進(jìn)一步的解決。

第一，轉(zhuǎn)化研究是個雙向自由流通過程，一方面是從基礎(chǔ)到臨床，將基礎(chǔ)研究的成果快速轉(zhuǎn)化到臨床應(yīng)用領(lǐng)域，為疾病的預(yù)防、診斷和治療提供更先進(jìn)的理念、手段、工具和方法；另一方面從臨床到基礎(chǔ)，將臨床問題進(jìn)一步轉(zhuǎn)入相應(yīng)的基礎(chǔ)領(lǐng)域進(jìn)行深入研究。但是在現(xiàn)實(shí)情境中，基礎(chǔ)研究和臨床研究（或科學(xué)與實(shí)踐）之間一直存在很大的鴻溝。一方面，國家投入大量的科研經(jīng)費(fèi)從事基礎(chǔ)研究，并產(chǎn)生眾多的科研成果，但是這些成果卻鮮為臨床工作者所知和應(yīng)用；另一方面，臨床工作者對治療為什么會起作用以及用于解釋病人改變的具體何種因果機(jī)制還知之甚少。如Johnson（2004）將心理治療人員的現(xiàn)狀概括為“當(dāng)治療者想明確地?cái)⑹鰡栴}、描繪治療目標(biāo)或者關(guān)注治療階段中的歷時變化過程時，往往沒有一致的、綜合的和研究所支撐的圖景。”因此，為了進(jìn)一步促進(jìn)轉(zhuǎn)化研究的成果，基礎(chǔ)研究者和臨床運(yùn)用者的有效溝通非常重要。這方面可以借鑒精神分裂癥領(lǐng)域的成功經(jīng)驗(yàn)。為了更好地運(yùn)用認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)的轉(zhuǎn)化研究，開發(fā)針對精神分裂癥認(rèn)知損傷的新干預(yù)方法，這一領(lǐng)域的研究者組織了3次國際性會議，召集了這一領(lǐng)域眾多知名學(xué)者，分階段討論了用于精神分裂癥治療方法開發(fā)的認(rèn)知機(jī)制、用于認(rèn)知神經(jīng)科學(xué)臨床轉(zhuǎn)化研究的認(rèn)知范式（涉及工作記憶、執(zhí)行控制、注意、長時記憶、知覺和社會認(rèn)知）選擇和相應(yīng)的神經(jīng)成像生物標(biāo)記（Barch et al.，2009；Carter et al.，2008，2011）。同樣，抑郁癥是種認(rèn)知和情緒障礙，相關(guān)的基礎(chǔ)研究積累了大量的抑郁癥的認(rèn)知機(jī)制、實(shí)驗(yàn)范式和神經(jīng)成像生物標(biāo)記的研究成果，有待這一領(lǐng)域的學(xué)者針對抑郁癥臨床運(yùn)用問題，進(jìn)行更有效的整理、歸納并提出主要的解決方法。

第二，從基礎(chǔ)研究到臨床運(yùn)用是個多階段過程。第一階段是利用神經(jīng)成像基礎(chǔ)研究的成果并將它們轉(zhuǎn)化為更有效的預(yù)防、診斷和治療干預(yù)手段。第二階段是將新的方法轉(zhuǎn)化到日常的臨床實(shí)踐和健康決策上去（Wang，Heinssen，Oliveri，Wagner，&Goodman，2009）。雖然當(dāng)前抑郁癥的神經(jīng)成像轉(zhuǎn)化研究在第一階段取得了較大的成績，但是第二階段的進(jìn)展還非常緩慢。這主要有以下幾個原因：首先，相關(guān)研究的數(shù)量、變異的結(jié)果和較少獨(dú)立的效度驗(yàn)證試驗(yàn)表明這方面的研究還處在嬰兒期（Schleim&Roiser，2009）。現(xiàn)有研究所采用的被試數(shù)量較少，這導(dǎo)致了實(shí)驗(yàn)的外部效度較低，已有的研究結(jié)果是否能夠推廣運(yùn)用到臨床情境中更多的病人身上還需要更加深入的研究。而且，研究結(jié)果的穩(wěn)定性和高效性有待進(jìn)一步驗(yàn)證，因?yàn)橐钟舭Y病人組與正常組所得到的差異顯著性結(jié)果并不一定適用于某個特定的抑郁癥患者。此外，臨床情境中的干預(yù)方法運(yùn)用強(qiáng)調(diào)其成本收益，神經(jīng)成像轉(zhuǎn)化研究的運(yùn)用缺乏這方面證據(jù)的支撐。其次，由于設(shè)備昂貴的費(fèi)用，對于大多數(shù)的臨床心理學(xué)家和門診部來說，神經(jīng)成像不容易獲得。