前言：中文期刊網(wǎng)精心挑選了基因治療的基本策略范文供你參考和學(xué)習(xí)，希望我們的參考范文能激發(fā)你的文章創(chuàng)作靈感，歡迎閱讀。

基因治療的基本策略范文1

【關(guān)鍵詞】 六味地黃丸/藥理學(xué) 肝腫瘤/中西醫(yī)結(jié)合療法 腫瘤/病理學(xué) 細(xì)胞凋亡 基因療法 自殺基因

疾病模型，動(dòng)物； 小鼠

肝癌的基因治療，特別是自殺基因治療，在控制腫瘤的增殖、預(yù)防和延緩復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，以及提高病人生活質(zhì)量方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)，成為肝癌治療活躍的研究領(lǐng)域［1-3］。從已有的研究結(jié)果來看，單純自殺基因治療仍難以達(dá)到完全根治腫瘤的目的。因此，尋找自殺基因療法的增效方法是目前各種腫瘤自殺基因治療的研究熱點(diǎn)之一。

免疫機(jī)制是旁觀者效應(yīng)產(chǎn)生的重要機(jī)制［4-5］，改善自殺基因療法作用的炎癥免疫微環(huán)境是自殺基因療法增效的主要途徑［6-7］。六味地黃丸具有增強(qiáng)機(jī)體免疫功能和直接抗腫瘤作用［8-13］，我們前期的研究結(jié)果顯示其對(duì)小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自殺基因治療具有增效作用［14］，本文旨在觀察其療效的病理學(xué)機(jī)制，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料和方法

1.1 主要試劑與儀器 細(xì)胞培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)板、濾膜、凍存管等為美國(guó)Corning公司和丹麥NUNC公司產(chǎn)品；Polybrene和G418為Sigma公司產(chǎn)品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清為Gibco公司產(chǎn)品；新生牛血清為杭州四季青公司產(chǎn)品。主要儀器為BNA3210型CO2培養(yǎng)箱（日本ESPEC），億鳴200病理圖像分析系統(tǒng)（中國(guó)億鳴）等。

1.2 動(dòng)物 昆明種小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清潔級(jí)，由廣州中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（合格證號(hào)：2003A008）。

1.3 細(xì)胞株 病毒包裝細(xì)胞PT67購(gòu)自美國(guó)Clontech公司，已于前期將重組pLXSNtk質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入PT67細(xì)胞內(nèi)記為PT67/tk［15］；小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H22購(gòu)自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心細(xì)胞庫(kù)。

1.4 藥物及配制 六味地黃丸為北京同仁堂產(chǎn)品（批號(hào)：4030098），于無菌室內(nèi)用消毒研缽加少許消毒蒸餾水研磨后，配成濃度為500g/L的藥液，小鼠給藥劑量為生藥10g·kg-1·d-1；丙氧鳥苷（GCV）為麗珠集團(tuán)湖北科益藥業(yè)有限公司產(chǎn)品（批號(hào)：040701），于無菌室以注射用生理鹽水25mL溶解，濃度為10g/L，小鼠給藥劑量為100mg·kg-1·d-1。

1.5 小鼠肝細(xì)胞癌細(xì)胞株H22的感染及GCV體外殺傷效應(yīng)的觀察 復(fù)蘇包裝細(xì)胞PT67/tk，吸取其培養(yǎng)上清液，加入H22的培養(yǎng)液中，上清液病毒感染H22細(xì)胞后用G418(800mg/L)篩選，獲得抗性細(xì)胞克隆，命名為H22/tk，將H22/tk和野生型H22細(xì)胞分別以2×103、3×103、5×103個(gè)/孔接種96孔板，同時(shí)加入不同濃度的GCV使終濃度分別為0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的細(xì)胞孔作對(duì)照，每一個(gè)濃度設(shè)4個(gè)復(fù)孔，于倒置顯微鏡下觀察殺傷效應(yīng)。

1.6 造模及治療

1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 將H22/tk和野生型H22按1：4混合（模擬臨床體內(nèi)病毒感染腫瘤細(xì)胞比率10%～20%）。混合后的細(xì)胞制備成1×1010個(gè)/L的細(xì)胞懸液，臺(tái)盼藍(lán)活細(xì)胞計(jì)數(shù)＞90%；按0.2mL/只（含2×106個(gè)腫瘤細(xì)胞）細(xì)胞懸液接種于小鼠的皮下。

1.6.2 分組及治療 昆明種小鼠90只，隨機(jī)分為5組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、六味地黃丸治療組、自殺基因治療組、聯(lián)合治療組（自殺基因聯(lián)合六味地黃丸），正常對(duì)照組10只，其他組各20只。正常對(duì)照組右前肢腋下注射生理鹽水0.2mL，其他各組右前肢腋下接種肝癌細(xì)胞懸液0.2mL。正常對(duì)照組和模型對(duì)照組第2～16天蒸餾水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理鹽水每天0.25mL/只；六味地黃丸治療組第2～16天六味地黃丸懸液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理鹽水每天0.25mL/只；自殺基因治療組第2～16天蒸餾水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；聯(lián)合治療組第2～16天六味地黃丸懸液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。

1.7 療效觀察及病理學(xué)機(jī)制

1.7.1 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 實(shí)驗(yàn)結(jié)束后處死動(dòng)物，用眼科剪分離剝?nèi)∧[瘤，萬分之一電子天平稱質(zhì)量，記錄結(jié)果。計(jì)算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。

1.7.2 病理學(xué)觀察及半定量分析 腫瘤用體積分?jǐn)?shù)10%中性甲醛固定，常規(guī)石蠟切片，蘇木素-伊紅（HE）染色，光鏡觀察腫瘤細(xì)胞的密度、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)，并采用盲法評(píng)分。腫瘤細(xì)胞密度：根據(jù)腫瘤細(xì)胞大小及密集程度分為+、++、+++3個(gè)等級(jí)。壞死分為+：灶狀壞死；++：網(wǎng)狀多灶狀壞死；+++：大片狀壞死。纖維結(jié)締組織根據(jù)腫瘤間質(zhì)內(nèi)及瘤周纖維的增生情況由低到高依次分為+、++、+++3個(gè)等級(jí)。腫瘤細(xì)胞核分裂像計(jì)數(shù)方法為每張HE染色切片隨機(jī)取5個(gè)非壞死區(qū)域高倍視野，對(duì)核分裂像進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫組化染色及陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù) 采用免疫組化SP法。切片脫蠟至水，入體積分?jǐn)?shù)1%過氧化氫溶液20min；磷酸鹽緩沖液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封閉液，20min；滴加增殖核抗原抗體，37℃濕盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素標(biāo)記二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記鏈霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；聯(lián)苯二胺(DAB)顯色，10min，Mayer蘇木素復(fù)染5s，干燥后中性樹膠封片。胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，每張切片隨機(jī)取5個(gè)非壞死區(qū)域高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞個(gè)數(shù)并取平均值。

1.7.4 腫瘤細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 采用原位末端標(biāo)記（TUNEL）法。切片脫蠟至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反應(yīng)液，37℃濕盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入體積分?jǐn)?shù)0.3%的過氧化氫，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根過氧化物酶標(biāo)記的鏈霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer蘇木素復(fù)染，干燥后中性樹膠封片。以胸腺組織為陽(yáng)性對(duì)照，不加末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶作為陰性對(duì)照。細(xì)胞核呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，每片隨機(jī)選取5個(gè)非壞死區(qū)域高倍視野，計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞的個(gè)數(shù)，以同一視野內(nèi)陽(yáng)性細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比表示細(xì)胞凋亡指數(shù)：p凋亡/%=(n陽(yáng)性細(xì)胞/n總細(xì)胞）×100%。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 計(jì)量資料采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析；等級(jí)資料采用Ridit分析。

2 結(jié)果

2.1 體外殺傷效應(yīng) 鋪板48h后，H22/tk100mg/L濃度孔中細(xì)胞開始死亡，表現(xiàn)為胞膜不完整，輪廓模糊，不透亮，形狀不規(guī)則，并且碎裂成小粒狀；10mg/L以下組僅見極少數(shù)細(xì)胞死亡，且增殖明顯。野生型H22細(xì)胞均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上濃度孔中絕大部分細(xì)胞碎裂成小粒狀，孔內(nèi)基本無活細(xì)胞生存；其他包括野生型H22細(xì)胞孔均呈現(xiàn)明顯的細(xì)胞增殖。表明體外病毒感染肝癌細(xì)胞成功，病毒攜帶的外源性自殺基因已表達(dá)且具有生物學(xué)活性，可用于體內(nèi)治療的實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 腫瘤質(zhì)量及抑瘤率 表1結(jié)果表明，各治療組腫瘤質(zhì)量均較模型對(duì)照組輕，其中聯(lián)合治療組與模型對(duì)照組比較，差異有顯著性意義（P＜0.05）。

2.3 病理學(xué)觀察及半定量分析 各組腫瘤細(xì)胞均表現(xiàn)為大小不一，核大深染，形狀不規(guī)則，腫瘤間質(zhì)內(nèi)及瘤周有不同程度的纖維結(jié)締組織增生，腫瘤組織內(nèi)均可見不同程度的大片壞死。模型對(duì)照組與六味地黃丸治療組均見腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞密度較大，自殺基因治療組與聯(lián)合治療組見腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞密度較低，僅自殺基因治療組腫瘤細(xì)胞密度與模型對(duì)照組比較差異有顯著性意義（P＜0.05），見表2，圖1。

2.4 腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡 六味地黃丸治療組和聯(lián)合治療組核分裂像明顯少于腫瘤模型組和自殺基因治療組，其中聯(lián)合治療組核分裂像最少。增殖核抗原陽(yáng)性細(xì)胞著色部位位于細(xì)胞核，呈黃褐色，六味地黃丸治療組與聯(lián)合治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均少于其他兩組，以聯(lián)合治療組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少。各治療組腫瘤細(xì)胞凋亡較模型對(duì)照組明顯增多，以聯(lián)合治療組最明顯，見表3，圖2-4。表1 各組小鼠腫瘤質(zhì)量及抑瘤率比較表2 各組病理分析統(tǒng)計(jì)結(jié)果表3 各組腫瘤細(xì)胞增殖與凋亡檢測(cè)結(jié)果

3 討論

自殺基因是指在一定條件下，可以引起細(xì)胞自動(dòng)死亡的基因。目前常用的自殺基因是通過編碼病毒或細(xì)菌的酶介導(dǎo)敏感性，而這些酶能把藥物的無活性形式轉(zhuǎn)化為毒性代謝產(chǎn)物，從而抑制核酸合成，導(dǎo)致細(xì)胞死亡［16］。

HSVtk/GCV為目前研究最深入、最具有應(yīng)用前景的腫瘤自殺基因治療系統(tǒng)之一，已廣泛應(yīng)用于各種惡性腫瘤的治療，并已進(jìn)入Ⅲ期臨床實(shí)驗(yàn)。HSVtk基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)胸苷激酶，可催化核苷類似物，如丙氧鳥苷（GCV）等形成單磷酸化產(chǎn)物，并在細(xì)胞內(nèi)磷酸激酶作用下形成三磷酸產(chǎn)物，干擾細(xì)胞分裂時(shí)DNA合成，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡［17］。

自殺基因治療由于存在旁觀者效應(yīng)（bystander effect）的獨(dú)特機(jī)制已成為惡性腫瘤基因治療的研究熱點(diǎn)和最具有應(yīng)用前景的腫瘤基因治療方法。所謂旁觀者效應(yīng)是指導(dǎo)入了自殺基因的腫瘤細(xì)胞加入前體藥物后，不僅自身被殺死，其鄰近未導(dǎo)入自殺基因的細(xì)胞也被殺死的現(xiàn)象［18］。由于存在旁觀者效應(yīng)，自殺基因療法對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用被有效地放大。旁觀者效應(yīng)形成機(jī)制的假說主要包括［18］：(1)"縫隙連接"機(jī)制；(2)免疫介導(dǎo)機(jī)制；(3)"細(xì)胞凋亡"機(jī)制；（4）介質(zhì)機(jī)制；(5)抗腫瘤血管生成機(jī)制，等等。

由于免疫介導(dǎo)機(jī)制在體內(nèi)自殺基因療法旁觀者效應(yīng)中的重要作用。改善自殺基因抗腫瘤作用的炎癥免疫微環(huán)境是提高自殺基因療法療效的重要策略。現(xiàn)代藥理學(xué)研究結(jié)果表明，滋陰補(bǔ)腎代表復(fù)方六味地黃丸（湯）對(duì)機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫均有明顯的增強(qiáng)效應(yīng)；能明顯改善荷瘤機(jī)體的免疫狀態(tài)，并具有一定的直接抗腫瘤作用。我們以六味地黃丸的免疫藥理作用與腫瘤自殺基因療法旁觀者效應(yīng)的免疫介導(dǎo)機(jī)制之內(nèi)在聯(lián)系為研究的切入點(diǎn)，以實(shí)驗(yàn)性肝細(xì)胞癌為治療對(duì)象，比較研究了自殺基因療法聯(lián)合六味地黃丸治療與單純自殺基因治療或單純六味地黃丸治療的抗腫瘤效果。研究結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用較單純自殺基因治療組或單純六味地黃丸治療組更為明顯［14］。

在進(jìn)一步的病理學(xué)研究中，雖然病理學(xué)觀察表明自殺基因治療組與聯(lián)合治療組的腫瘤組織內(nèi)細(xì)胞密度較低，各治療組纖維組織增生均較明顯，但通過盲法對(duì)腫瘤的病理定量分析研究則顯示腫瘤細(xì)胞密度、腫瘤壞死、間質(zhì)反應(yīng)各組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。造成這種現(xiàn)象的原因最有可能是觀察者不能很好地把握分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)，以及病理半定量分析的不夠精確，這有待于通過多次的重復(fù)實(shí)驗(yàn)及增加樣本量或運(yùn)用更為精確的分析方法（如圖像分析等）來解決。 腫瘤的生長(zhǎng)速度與腫瘤細(xì)胞的增殖與凋亡速度相關(guān)。PCNA與細(xì)胞核分裂像均為評(píng)價(jià)細(xì)胞增殖能力的重要指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：聯(lián)合治療組與六味地黃丸治療組的PCNA陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及核分裂像數(shù)均少于模型組、自殺基因治療組，其中聯(lián)合治療組與模型組、自殺基因治療組比較，差異均有顯著性意義(P＜0.05)，結(jié)果說明六味地黃丸可能具有一定的抑制腫瘤增殖的作用；其他各組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而自殺基因治療組從絕對(duì)值看略高于模型對(duì)照組，其結(jié)果與文獻(xiàn)報(bào)導(dǎo)自殺基因治療后殘存腫瘤細(xì)胞會(huì)加速增殖相符。同時(shí)，從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果來看，各治療組腫瘤細(xì)胞凋亡均有增多，聯(lián)合治療也顯示了更明顯的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的效果。

本研究結(jié)果提示：腫瘤細(xì)胞增殖抑制和腫瘤細(xì)胞凋亡增多都與六味地黃丸對(duì)肝癌自殺基因治療的增效作用有關(guān)。其機(jī)理可能是在六味地黃丸的參與下，不僅發(fā)揮了直接抑制腫瘤細(xì)胞增殖和誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的功效，而且通過對(duì)機(jī)體整體與局部的抗腫瘤免疫的調(diào)節(jié)或其他機(jī)制（如"縫隙連接"機(jī)制等），使得自殺基因治療的旁觀者效應(yīng)在力度上得以增強(qiáng)，在時(shí)限上得以延續(xù)，從而更好地發(fā)揮了自殺基因療法的抗腫瘤作用。

【參考文獻(xiàn)】

［1］王建立，徐克森，壽楠海.肝癌的基因治療［J］.中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展，2004，7(3)：133.

［2］孫曉毅，吳在德.肝癌的自殺基因治療［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·外科學(xué)分冊(cè)，1998 ，25(1)：13.

［3］Ghoumari A M，Rixe O，Yarovoi S V，et al.Gene transfer in hepatocarcinoma cell lines: in vitro optimization of a virusfree system［J］.Gene Ther，1996，3(6)：483.

［4］孫春曉，何榮根.自殺基因治療與免疫調(diào)節(jié)研究進(jìn)展［J］.國(guó)外醫(yī)學(xué)·免疫學(xué)分冊(cè)，1999，22(4)：218.

［5］Freeman S M，Ramesh R，Marrogi A J.Immune system in suicidegene therapy［J］.Lancet，1997，349(9044)：2.

［6］Jones R K，Pope I M，Kinsella A R，et al.Combined suicide and granulocytemacrophage colonystimulating factor gene therapy induces complete tumor regression and generates antitumor immunity［J］.Cancer Gene therapy，2000，7(12)：1519.

［7］Pizzato M，F(xiàn)ranchin E，Calvi P，et al.Production and characterization of a bicistronic Moloneybased retroviral vector expressing human interleukin 2 and herpes simplex virus thymidine kinase for gene therapy of cancer［J］.Gene Ther，1998，5(7)：1003.

［8］杜標(biāo)炎.腎陰虛造型及補(bǔ)腎中藥對(duì)小鼠免疫功能的影響［J］.廣州中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，1995，12(4)：30.

［9］杜標(biāo)炎，徐勤，羅惠，等.六味地黃湯抗糖皮質(zhì)激素所致小鼠胸腺萎縮的病理學(xué)研究［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，16(2)：111.

［10］杜標(biāo)炎，徐勤，吳紹鋒，等.六味地黃湯對(duì)糖皮質(zhì)激素腎陰虛模型免疫器官淋巴細(xì)胞凋亡的抑制作用（Ⅰ）［J］.廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2000，17(3)：204.

［11］賈泰元.六味地黃方的免疫調(diào)節(jié)作用［J］.中成藥，1994，16(9)：34.

［12］劉福君，茹祥斌.地黃及六味地黃湯（丸）的免疫藥理及抗腫瘤作用［J］.中草藥，1996，27(2)：116.

［13］宋麗麗，張瑜，張大祿.六味地黃方的免疫、抗腫瘤藥理研究［J］.中成藥，2001，23(12)：910.

［14］杜標(biāo)炎，王慧峰，譚宇蕙，等.六味地黃丸對(duì)小鼠移植性肝癌自殺基因治療的增效作用［J］. 廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2007，24(2)：132.

［15］孫春曉，何榮根.惡性腫瘤自殺基因治療研究進(jìn)展［J］.實(shí)用腫瘤雜志，1999，14(4)：255.

［16］翟羽，呂占軍.反應(yīng)停對(duì)小鼠肝癌細(xì)胞H22移植瘤生長(zhǎng)的影響［J］.癌癥，2003，22（12）：1301.

基因治療的基本策略范文2

【關(guān)鍵詞】 系統(tǒng)觀 腫瘤 綜合治療

腫瘤是機(jī)體中正常細(xì)胞在不同始動(dòng)與促進(jìn)因素長(zhǎng)期作用下，所產(chǎn)生的增生與異常分化形成的新生物。隨著疾病譜的改變，腫瘤已成為目前導(dǎo)致死亡的常見原因之一，隨著現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)的發(fā)展和突飛猛進(jìn)，給科學(xué)技術(shù)方法研究帶來革命性變化，腫瘤逐漸地被看成為一種全身性疾?S紗碩矗琢鮒瘟乒勰畋惴⑸嗣饗緣淖潁琢鱟酆現(xiàn)瘟葡低徹塾υ碩＜創(chuàng)酉低徹鄣慕嵌雀薟∪說幕遄純霾±聿∑謨敕⒄骨魘?有計(jì)劃地、合理地綜合應(yīng)用現(xiàn)有的各種治療手段，以期較大幅度地提高病人的生存率，改善病人的生存質(zhì)量。

1 腫瘤發(fā)生、發(fā)展的系統(tǒng)觀

所謂系統(tǒng)是指若干要素按一定的結(jié)構(gòu)相互聯(lián)系組成具有特定的功能的有機(jī)整體，而這個(gè)整體本身又是它所從屬的一個(gè)更大系統(tǒng)的一個(gè)組成部分。系統(tǒng)科學(xué)的觀點(diǎn)，就是要求把研究對(duì)象視為系統(tǒng)，把事物的普遍聯(lián)系和永恒運(yùn)動(dòng)看成一個(gè)整體過程，全面的把握和控制，綜合的探索系統(tǒng)中要素與要素、要素與系統(tǒng)、系統(tǒng)與環(huán)境、系統(tǒng)與系統(tǒng)的相互作用和變化規(guī)律，把握住對(duì)象的內(nèi)環(huán)境與外環(huán)境的關(guān)系，以便有效地認(rèn)識(shí)和改造對(duì)象［1］。任何系統(tǒng)都是開放的系統(tǒng)，每一個(gè)系統(tǒng)的存在都有整體性、層次性及動(dòng)態(tài)平衡性等基本特征。一個(gè)生物學(xué)意義上的人，也完全可以看成是一個(gè)開放系統(tǒng)。這一系統(tǒng)本身就由各個(gè)子系統(tǒng)（循環(huán)、呼吸、消化等系統(tǒng)）組成，各系統(tǒng)之間并非獨(dú)立存在，有相互影響、相互制約的作用關(guān)系，這一大系統(tǒng)和外界進(jìn)行不斷的物質(zhì)和能量的交換，借以維持自身的穩(wěn)態(tài)，達(dá)到功能的最優(yōu)化，即生存質(zhì)量最佳化。所以有學(xué)者認(rèn)為：決定疾病發(fā)生發(fā)展的，不僅僅在于器官、組織、細(xì)胞、基因等各種要素的性能，更重要的是要素和要素之間，系統(tǒng)和環(huán)境之間的相互聯(lián)系和作用，考察疾病的本質(zhì)，必須把注意和焦點(diǎn)放在相互聯(lián)系和相互作用上［2］。上述說法就是從系統(tǒng)水平進(jìn)行考察，而不同局限于單個(gè)細(xì)胞或基因的功能行為。那么，在腫瘤的發(fā)生學(xué)上，是否肯定“基因決定論”的觀點(diǎn)呢？近幾年的研究提出，細(xì)胞基因的缺失、突變等導(dǎo)致的細(xì)胞生長(zhǎng)失控、惡變是發(fā)生腫瘤的主要機(jī)制。從分子水平看，腫瘤的病因主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活，細(xì)胞周期調(diào)控基因的改變，前者是發(fā)病的基礎(chǔ)，并通過后者發(fā)揮作用。但對(duì)于這么一個(gè)子系統(tǒng)（核酸系統(tǒng)）的考察，并不能完全解釋腫瘤的發(fā)生。核酸系統(tǒng)之間，核酸與蛋白質(zhì)系統(tǒng)之間，核酸與神經(jīng)-內(nèi)分泌系統(tǒng)之間，核酸與內(nèi)、外環(huán)境之間均存在著千絲萬縷的聯(lián)系。癌基因的激活和抑癌基因的失活并不會(huì)無緣無故發(fā)生，研究已表明，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個(gè)多基因、多步驟、多因素的漸進(jìn)過程。環(huán)境污染致癌因素的刺激，化學(xué)致癌因素如苯、氯霉素、亞硝酸胺的影響，物理致癌因素，腫瘤的病毒病因，其他如人體內(nèi)分泌失調(diào)、遺傳、慢性刺激和創(chuàng)傷均可致瘤。而且單因基因突變而產(chǎn)生的腫瘤細(xì)胞也未必能發(fā)展成腫瘤，在人體這樣一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)中，神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫等內(nèi)環(huán)境隨時(shí)進(jìn)行警惕的監(jiān)視，只有整個(gè)大系統(tǒng)紊亂，監(jiān)視功能障礙，腫瘤細(xì)胞才能逃脫系統(tǒng)監(jiān)視，才能進(jìn)一步發(fā)展。而真正發(fā)展到器官的癌變，往往要經(jīng)歷數(shù)年甚至幾十年的時(shí)間，因?yàn)橐坏┫到y(tǒng)的功能恢復(fù)正常，腫瘤細(xì)胞可被機(jī)體清除，只有在內(nèi)外環(huán)境的反復(fù)作用下，機(jī)體各系統(tǒng)功能的紊亂無法再協(xié)調(diào)一致，才使得腫瘤得以發(fā)展甚至轉(zhuǎn)移。綜上所述，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展并非“基因決定論”可以完全解決，相反的，只有從系統(tǒng)的整體的水平去考察外界環(huán)境和機(jī)體的作用，機(jī)體自身各個(gè)子系統(tǒng)的相互作用，每個(gè)子系統(tǒng)內(nèi)部各要素的相互關(guān)系，才能很好地認(rèn)識(shí)其病因和發(fā)病機(jī)制。

2 系統(tǒng)方法論原則對(duì)腫瘤治療的思路指導(dǎo)

進(jìn)入20世紀(jì)之后，醫(yī)學(xué)漸漸進(jìn)入理性階段。隨著對(duì)腫瘤本質(zhì)認(rèn)識(shí)的不斷深入，更由于腫瘤局部治療方法的停滯不前，局部治療后預(yù)后不佳，使更多的學(xué)者意識(shí)到局部治療的弊端。20世紀(jì)80年代，惡性腫瘤的治療方式有手術(shù)、放療、化療、生物治療，其中以根治性手術(shù)為主，對(duì)失去手術(shù)機(jī)會(huì)的中晚期惡性腫瘤只通過單一的放療或化療來延長(zhǎng)生存期，有效率低，易于復(fù)發(fā)，治療手段單一。80年代后期，由于化療藥物的不斷推陳出新，腫瘤學(xué)理論的不斷完善，化療的地位日益被重視，發(fā)展了誘導(dǎo)化療、術(shù)后化療、放化療、熱化療等各種綜合治療模式，手術(shù)方式也由根治性手術(shù)向保守性手術(shù)、保留器官功能方向發(fā)展，因此，21世紀(jì)的腫瘤治療更注重強(qiáng)調(diào)根據(jù)病人的身體狀況、腫瘤的病理類型、侵犯范圍（病期）和發(fā)展趨向，有計(jì)劃合理地應(yīng)用現(xiàn)有的治療手段，以期較大幅度的提高治愈率，改善病人的生活質(zhì)量，腫瘤治療觀念由此發(fā)生了根本性的轉(zhuǎn)變，腫瘤綜合治療應(yīng)運(yùn)而生［3］。所謂腫瘤綜合治療是指：根據(jù)病人的機(jī)體狀況，腫瘤的病理類型，侵犯范圍（病期）和發(fā)展趨勢(shì)，有計(jì)劃地、合理地應(yīng)用現(xiàn)有的治療手段，制定個(gè)體化治療方案，以期大幅度地提高治愈率，改善病人的生存質(zhì)量［4］。可以說，腫瘤治療學(xué)研究顯示出多學(xué)科的合作與補(bǔ)充，腫瘤的治療也已進(jìn)入綜合治療的時(shí)代。按照系統(tǒng)論整體性原理來講即系統(tǒng)論中各組分相加的和大于各組分的代數(shù)和。惡性腫瘤綜合治療個(gè)體化的決策，將手術(shù)、化療、放療、中醫(yī)中藥治療及生物基因治療，依照不同病例特點(diǎn)，進(jìn)行有機(jī)組合，以期達(dá)到最佳的治療效果［5］。但它不是將各種治療手段的簡(jiǎn)單疊加或隨意輪番應(yīng)用，孰先孰后，孰輕孰重，均要因人而異，要經(jīng)過多學(xué)科的充分討論協(xié)商后決定。在決策過程中，既要注意盡量避免盲目一味強(qiáng)調(diào)某一學(xué)科在腫瘤治療中的重要性和單一治療方法在腫瘤治療中的過分?jǐn)U大應(yīng)用，又要注意各個(gè)學(xué)科之間的密切合作，相互配合，互補(bǔ)應(yīng)用，共同來承擔(dān)對(duì)患者的綜合治療。這就要求無論是哪一個(gè)學(xué)科的醫(yī)生，都要做到不僅能夠了解自己本學(xué)科治療手段的特點(diǎn)和不足，還要了解其他相關(guān)學(xué)科治療手段的特點(diǎn)和不足，真正做到心中有數(shù)。要能夠善于應(yīng)用其他相關(guān)學(xué)科的成果和特長(zhǎng)來對(duì)自己本學(xué)科的治療加以充實(shí)、完善和提高。特別是在科學(xué)技術(shù)迅猛發(fā)展和技術(shù)更新速度不斷加快的今天，及時(shí)了解并掌握專業(yè)技術(shù)的發(fā)展動(dòng)態(tài)和引進(jìn)先進(jìn)技術(shù)并加以應(yīng)用與創(chuàng)新，以跟上時(shí)代和科技發(fā)展的步伐。當(dāng)前，越來越多的腫瘤病人首診時(shí)都選擇到腫瘤內(nèi)科，主要是因?yàn)槟[瘤內(nèi)科的醫(yī)生能夠善于接受和利用新的醫(yī)學(xué)研究成果，以病人利益為重，改變過去誰先接診誰收治的不規(guī)范醫(yī)療行為，在對(duì)腫瘤病人的診斷以及設(shè)計(jì)和規(guī)劃總體治療策略上起到了主導(dǎo)作用，不僅能夠使腫瘤病人真正享受到現(xiàn)代腫瘤綜合治療模式與治療方案?jìng)€(gè)體化所帶來的益處，而且也充分體現(xiàn)了社會(huì)的文明進(jìn)步與人文關(guān)懷［6～13］。 我們?cè)谂R床工作中必須要按照醫(yī)學(xué)倫理學(xué)“ 醫(yī)乃仁術(shù)”和“ 循證醫(yī)學(xué)”，謹(jǐn)慎、準(zhǔn)確和明智地應(yīng)用當(dāng)前所能獲得的最好的研究證據(jù)，結(jié)合個(gè)人的專業(yè)技能和多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，考慮病人的經(jīng)濟(jì)承受能力和意愿，并將此結(jié)合最優(yōu)化的原則來作出具體的治療決策。例如目前放化療綜合治療的臨床應(yīng)用多集中于頭頸部癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌中，通過放化療綜合治療所獲得的較高的局控率和較晚發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，為我們提供了一條中晚期惡性腫瘤治療的新途徑。靜脈化療起到了全身治療的目的－在于徹底清除微小轉(zhuǎn)移灶，放療作為一種局部治療，二者聯(lián)合應(yīng)用的優(yōu)點(diǎn)不言而喻，中晚期惡性腫瘤傳統(tǒng)的單一治療模式已遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能適應(yīng)目前臨床要求，放化療綜合治療不僅提高生存率，對(duì)延緩發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移也顯示出了不可比擬的優(yōu)越性，尤其是同期放化療的應(yīng)用將中晚期惡性腫瘤的治療帶上一個(gè)新的臺(tái)階［14］。

轉(zhuǎn)貼于

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，作為生物醫(yī)學(xué)前沿的人類基因組計(jì)劃研究步入實(shí)質(zhì)性階段，基因治療腫瘤成為熱門。基因治療能否給人類帶來巨大的革命，已成為現(xiàn)代醫(yī)學(xué)大家的研究方向。所謂基因治療是指把目的基因?qū)氚屑?xì)胞和宿主體內(nèi)，通過基因組合，成為宿主遺傳物質(zhì)的一部分，糾正錯(cuò)誤的基因表達(dá)和基因表達(dá)的錯(cuò)誤，以達(dá)到治療的目的［15］。通常包括四方面的內(nèi)容：基因修正-糾正缺陷基因的突變堿基序列；基因置換-由正常基因換掉疾病基因；基因修飾-將目的基因?qū)氩∽兗?xì)胞的基因，其表達(dá)產(chǎn)物用以修飾缺陷基因?qū)е碌募?xì)胞功能異常，或使正常功能得以加強(qiáng)；基因失活-應(yīng)用反義技術(shù)封閉不該表達(dá)的基因，以抑制有害基因，或直接抑制有害基因的表達(dá)。雖然就基因治療的概念來說，體現(xiàn)的是分子水平的基本理論和原則，但其治療的目的是為了抑制腫瘤的生長(zhǎng)或達(dá)到逆轉(zhuǎn)、殺死腫瘤細(xì)胞，所以在治療過程中仍需考慮所作用的個(gè)體系統(tǒng)，如外界的環(huán)境因素，機(jī)體的內(nèi)環(huán)境和免疫功能的影響等。因?yàn)閷⒒驅(qū)爰?xì)胞，使正常基因得以表達(dá)，或使病變基因不表達(dá)，或誘導(dǎo)已有的腫瘤細(xì)胞分化、凋亡，都不是單單一個(gè)分子水平可以解決的。例如將反義基因?qū)爰?xì)胞，以封閉有害基因的表達(dá)，在體外實(shí)驗(yàn)中，所要觀察的指標(biāo)限于細(xì)胞水平，如基因轉(zhuǎn)染的百分率，對(duì)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和抑制率等。但一旦進(jìn)入體內(nèi)實(shí)驗(yàn)階段，就不能不考慮機(jī)體的整體性，如反義核苷酸對(duì)腫瘤細(xì)胞有抑制作用，那么對(duì)正常細(xì)胞或組織器官是否有毒性作用呢？在體內(nèi)，在各種調(diào)節(jié)機(jī)制的作用下或各種核酸酶等水解酶的作用下，反義核苷酸是否能成功地進(jìn)入細(xì)胞封閉有害基因呢？再如用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移有效性高并容易獲得穩(wěn)定表達(dá)，但這一插入突變是否會(huì)引起潛在的癌基因激活，從而又引發(fā)新的腫瘤呢？顯然，在腫瘤的基因治療的研究中，在體外細(xì)胞水平中有良好的效應(yīng)，但進(jìn)入機(jī)體系統(tǒng)中，其效果不一定良好，而且歷史上也有基因治療失敗的例子。這正是因?yàn)槿梭w是一個(gè)復(fù)雜的系統(tǒng)，各個(gè)子系統(tǒng)之間有復(fù)雜的相互關(guān)系，而腫瘤的發(fā)生和發(fā)展也并非由基因單獨(dú)決定，如果單從基因這一方面去考慮，而忽略了治療所處的整體環(huán)境，忽略了治療應(yīng)采取的整體措施，往往會(huì)導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)的失敗。任何對(duì)腫瘤疾病的治療方法需經(jīng)過人體內(nèi)試驗(yàn)，要從系統(tǒng)和整體的水平觀察治療有效性和可能存在的副作用，腫瘤基因治療也需遵循系統(tǒng)觀點(diǎn)，用整體性、動(dòng)態(tài)性、聯(lián)系性的原理，達(dá)到最佳的預(yù)期效果。但在實(shí)際工作中，尚有許多疑難問題，對(duì)于這些問題解決離不開系統(tǒng)科學(xué)觀的支持，我們不能忽視機(jī)體的整體性，不能用局限、部分、分子細(xì)胞水平來以偏概全，只有用系統(tǒng)的環(huán)境中解決這些難題，才會(huì)有實(shí)用價(jià)值和臨床價(jià)值。所以從腫瘤的綜合治療可以看出，綜合手術(shù)、化療、放療及生物基因治療、中醫(yī)中藥治療、內(nèi)分泌治療等手段，依據(jù)具體情況具體分析的原則，針對(duì)具體的病例，制訂相應(yīng)的個(gè)性化的治療方案，最終達(dá)到最佳綜合療效，在某些領(lǐng)域已顯示了令人鼓舞的前景。隨著人類基因組計(jì)劃的完成，人類表觀基因組協(xié)會(huì)（humnan epigenome consortium， HEC）在2003年10月正式宣布開始實(shí)施人類表觀基因組計(jì)劃（human epigenome proiect， HEP） ，通過大規(guī)模檢測(cè)人類基因組，基因組學(xué)研究進(jìn)入一個(gè)新的階段，也為解開生命奧秘及征服腫瘤等疾病帶來了希望［16］。人類攻克癌癥近在咫尺，但仍有很長(zhǎng)的路要走，尚有不少難題有待在今后實(shí)踐中予研究解決。讓我們記住著名的系統(tǒng)科學(xué)家拉茲洛教授的話：“今天我們正目睹一場(chǎng)思維方式的轉(zhuǎn)化：轉(zhuǎn)向嚴(yán)謹(jǐn)精細(xì)而又整體的理論。這就是說：要構(gòu)成擁有它們自己的性質(zhì)和關(guān)系集成的集合體，按照同整體聯(lián)系在一起的事實(shí)和事件來思考。”［17］。

【參考文獻(xiàn)】

1 許為民，王詩(shī)安，張鋼，等.自然辯證法新編.杭州：浙江大學(xué)出版社，1999，165-166.

2 周東浩，周明愛.論疾病的本質(zhì).醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2001，22（4）：43-44.

3 黃宗堂.腫瘤綜合治療中的系統(tǒng)論思想.天津醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，1999，12：16.

4 Balch C.Multimodal Care of Patents with cancer In Pollock RE， Kurerer H Balch C:Multidisciplinary Cancer Management Course ASCO，2005，1-12.

5 吳一龍.惡性腫瘤治療方法的發(fā)展及其認(rèn)識(shí)論意義.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，1994，12（7）：18.

6 張魯文. 關(guān)于惡性腫瘤的綜合治療問題. 臨床軍醫(yī)雜志，2004，32（5）：108-110.

7 邱志祥. 惡性腫瘤的綜合治療.中國(guó)醫(yī)院用藥評(píng)價(jià)與分析，2004，4（1）：55-57.

8 曲梅. 腫瘤綜合治療中的系統(tǒng)觀.醫(yī)學(xué)與哲學(xué)，2002，23（6）：45.

9 李海濱，范江河，董紅霞. 淺談腫瘤的綜合治療.邯鄲醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校學(xué)報(bào)，2004，17（4）：360.

10 劉穎，徐妮，韓振海. 循證醫(yī)學(xué)與腫瘤的綜合治療.中華實(shí)用中西醫(yī)雜志，2004，4（24）：3794-3795.

11 劉瑞祺，遲志宏，介雅慧. 循證醫(yī)學(xué)與腫瘤綜合治療.白求恩軍醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2003，1（2）：67-69.

12 陳正堂. 惡性腫瘤的綜合治療.重慶醫(yī)學(xué)，2002，31（2）：65-67.

13 張魯文，畢素棟. 循證醫(yī)學(xué)與腫瘤臨床實(shí)踐.腫瘤防治雜志，2003，10（8）：881-882.

14 陳桂園.中晚期非小細(xì)胞肺癌化療和放療綜合治療進(jìn)展.中國(guó)癌癥雜志，2000，10（4）：357.

15 孫靖中，周雄.腫瘤分子生物學(xué).北京：人民衛(wèi)生出版社，1998，121.

基因治療的基本策略范文3

[關(guān)鍵詞]RNAi；dsRNA；siRNA

[中圖分類號(hào)]R394[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A[文章編號(hào)]1673-7210（2007）10（b）-007-03

RNAi（RNA interfering，也稱RNA干擾）是利用小雙鏈RNA特異阻斷特定基因的表達(dá)，并促使靶mRNA降解，從而使細(xì)胞表現(xiàn)出某種特定基因缺失表型的現(xiàn)象。由于RNAi對(duì)基因表達(dá)的阻斷具有高效、特異性，已迅速發(fā)展成為代替基因敲除的遺傳工具。

1 RNAi的分子作用機(jī)制

經(jīng)過眾多學(xué)者的研究，現(xiàn)已基本闡明了RNAi的作用機(jī)制。在不同生物中RNAi的作用機(jī)制各有不同,主要分為兩種：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的長(zhǎng)雙鏈RNA的非特異效應(yīng)和21～23 nt的短雙鏈RNA的特異效應(yīng)[1]。RNAi的特異效應(yīng)作用機(jī)制是在轉(zhuǎn)錄水平、轉(zhuǎn)錄后水平、翻譯水平等多個(gè)不同的水平上實(shí)現(xiàn)的。其中以siRNA轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi研究最為深入，應(yīng)用最為廣泛，下文將做主要介紹(圖1)。

1.1 轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi機(jī)制

轉(zhuǎn)錄后水平的RNAi機(jī)制是在對(duì)線蟲、果蠅等生物體進(jìn)行研究而進(jìn)一步推導(dǎo)得出來的。不同研究領(lǐng)域的學(xué)者相繼提出了多種RNAi機(jī)制的模型，這些模型大致都將RNAi分為兩個(gè)階段：起始階段和效應(yīng)階段。

起始階段包括：①dsRNA的導(dǎo)入：包括由外源導(dǎo)入或由轉(zhuǎn)基因、轉(zhuǎn)座子、病毒感染等各種方式引入的dsRNA;②dsRNA在細(xì)胞內(nèi)被一種命名為Dicer的酶切割成21~23 nt長(zhǎng)的小分子干擾RN斷（short interfering RNA, siRNA）。

效應(yīng)階段包括：①在siRNA反義鏈指導(dǎo)下，雙鏈siRNA與一個(gè)不同于DICER的RNA酶結(jié)合形成沉默復(fù)合物RISC。②siRNA雙鏈解旋，正義鏈被釋放出來，RISC被激活。③活化的RISC通過堿基配對(duì)識(shí)別互補(bǔ)的靶mRNA，siRNA反義鏈與mRNA復(fù)合體中換位，并在距siRNA的3'末端12 nt處切割靶mRNA，從而實(shí)現(xiàn)了對(duì)mRNA的降解。降解位點(diǎn)多為尿嘧啶。

某些學(xué)者認(rèn)為RNAi過程中還具有自身循環(huán)放大機(jī)制，并將其歸為模型的第三階段――循環(huán)放大階段，其機(jī)制大致如下：

在效應(yīng)階段，活化的RISC結(jié)合mRNA后，內(nèi)切核酸酶將mRNA切割成12~23 nt的片段，特異性地抑制了靶基因的表達(dá)。同時(shí)，釋放出來的siRNA可以作為一種特殊引導(dǎo)物，在RNA依賴的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA為模板合成新的dsRNA，后者又被降解為新的siRNA，進(jìn)入上述循環(huán)，呈放大效應(yīng)。此過程又稱為隨機(jī)降解性多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）[2]。

1.2翻譯水平的RNAi機(jī)制[1]

翻譯水平上的RNAi是抑制相應(yīng)mRNA的翻譯，使相應(yīng)的蛋白質(zhì)表達(dá)受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由長(zhǎng)度約70 nt的RNA形成的莖環(huán)樣前體，經(jīng)Dicer酶作用后形成長(zhǎng)約21～23 nt的dsRNA， 通過RISC結(jié)合在相應(yīng)mRNA的3'末端非翻譯區(qū)上,進(jìn)而阻斷mRNA的翻譯。

1.3轉(zhuǎn)錄水平上的RNAi機(jī)制[1]

該機(jī)制是通過siRNA與互補(bǔ)的DNA直接發(fā)生作用，激發(fā)同源DNA甲基化的加強(qiáng)，使目的基因轉(zhuǎn)錄受限，表達(dá)關(guān)閉，進(jìn)而加強(qiáng)了基因沉默。有報(bào)道dsRNA可誘導(dǎo)組蛋白H3及相應(yīng)DNA區(qū)域甲基化。如果甲基化出現(xiàn)在啟動(dòng)子區(qū)域,則轉(zhuǎn)錄就不能進(jìn)行,如甲基化出現(xiàn)在編碼區(qū),則轉(zhuǎn)錄進(jìn)行,但在轉(zhuǎn)錄后水平上沉默。

1.4 非特異效應(yīng)

許多研究表明，當(dāng)向哺乳動(dòng)物轉(zhuǎn)染大于30 nt的長(zhǎng)雙鏈RNA（dsRNA）時(shí)，由于dsRNA激活雙鏈RNA依賴的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途徑[3]，使EIF-2α因子磷酸化，進(jìn)而非特異性地抑制翻譯，從而使細(xì)胞內(nèi)發(fā)生全面的細(xì)胞沉默。

1.5 RNAi過程所涉及的主要因子

siRNA：是RNAi作用賴以發(fā)生的重要中間效應(yīng)分子。它是長(zhǎng)約21~23 nt的雙鏈RNA小分子，與靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每條單鏈 的3'末端均有2~3個(gè)非配對(duì)的堿基[4]。

Dicer酶：Dicer酶（在果蠅中發(fā)現(xiàn)）是一種RNaseⅢ家族中的一種識(shí)別dsRNA的酶，據(jù)報(bào)道其結(jié)構(gòu)含有1個(gè)PAZ結(jié)構(gòu)域，1個(gè)氨基螺旋酶結(jié)構(gòu)域，2個(gè)RNaseⅢ模體及2個(gè)dsRNA結(jié)構(gòu)域。在dsRNA導(dǎo)入后，Dicer酶以ATP依賴的、持續(xù)方式連續(xù)切割dsRNA。在對(duì)dsRNA進(jìn)行切割時(shí)，Dicer以二聚體形式參與，每個(gè)二聚體包括4個(gè)活性中心，在降解RNA時(shí)其中的2個(gè)要失活,從而使降解過程每隔一定間隔進(jìn)行,這個(gè)間隔正好為22個(gè)核苷酸,即每隔22個(gè)核苷酸Dicer酶將dsRNA降解一次。而Dicer酶結(jié)構(gòu)上的微小改變將會(huì)引起間隔的改變,所以不同的物種產(chǎn)生的siRNA長(zhǎng)度也略有不同[1]。

RdRP：許多實(shí)驗(yàn)證明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前僅知其主要是在單鏈siRNA指導(dǎo)下擴(kuò)增RNA而加速RNA的過程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低濃度下高效快速地進(jìn)行。

ATP[5]：ATP在siRNA介導(dǎo)中起重要作用，dsRNA被降解為siRNA的過程需要ATP；siRNA解旋，反義鏈與RISC前體結(jié)合形成RISC的過程也依賴ATP。研究還發(fā)現(xiàn)，RNAi過程中外源性ATP不能起促進(jìn)作用。

2 RNAi的特征

高穩(wěn)定性：以3'末端突出的TT堿基的dsRNA尤為穩(wěn)定，無需象反義核酸那樣進(jìn)行進(jìn)行廣泛的化學(xué)修飾以提高半衰期[6]。

高效率：在低于反義核酸幾個(gè)數(shù)量級(jí)的濃度下，就能使目標(biāo)基因的表達(dá)降到極低水平甚至完全抑制，從而產(chǎn)生缺失突變體表型[7]。

高特異性：siRNA除正義鏈3'末端突出的2個(gè)堿基在序列識(shí)別中不起主要作用外，其他單個(gè)堿基的改變均可能使RNAi效應(yīng)大大減弱。而針對(duì)同源基因共有序列的RNAi則導(dǎo)致同源基因共同失活[5]。

高傳遞性：RNAi抑制基因表達(dá)的效應(yīng)可以穿過細(xì)胞界限，在不同細(xì)胞間長(zhǎng)距離傳遞和維持，在某些生物中RNAi還可以傳遞到后代中去。

3 RNAi應(yīng)用過程需要解決的幾個(gè)問題

避免非特異性效應(yīng)：前述已闡明，在哺乳動(dòng)物中，當(dāng)大于30 nt的dsRNA被導(dǎo)入時(shí)，可激活PKR途徑而導(dǎo)致非特異性抑制。這就要求在設(shè)計(jì)dsRNA時(shí)必須考慮該dsRNA導(dǎo)入時(shí)能否避免非特異性效應(yīng)的出現(xiàn)。多數(shù)實(shí)驗(yàn)表明，以21~23 nt為最佳選擇。

本文為全文原貌 未安裝PDF瀏覽器用戶請(qǐng)先下載安裝 原版全文

干涉dsRN段的獲取和導(dǎo)入：在實(shí)際應(yīng)用中，siRNA的長(zhǎng)度、結(jié)構(gòu)、組成及其觸發(fā)的效果基因、種屬、序列、細(xì)胞類型、甚至實(shí)驗(yàn)體系的不同而有變異。目前，siRNA的獲取大多數(shù)仍舊是生化合成，其設(shè)計(jì)仍處于試驗(yàn)階段，能否成功地設(shè)計(jì)出合理實(shí)用的siRNA對(duì)其能否廣泛應(yīng)用起決定性作用。對(duì)RNAi效應(yīng)的調(diào)控：目前對(duì)RNAi的研究還限于以雙鏈干涉片段抑制特定基因的表達(dá)，對(duì)其調(diào)控的干涉較少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潛在靶位、活性片段濃度等都是RNAi有效性發(fā)揮的影響因素。Yang等還證實(shí)RNAi現(xiàn)象可被過剩的不相關(guān)的dsRNA競(jìng)爭(zhēng)性抑制，深入的研究表明，甚至過剩的正義鏈與反義鏈也可競(jìng)爭(zhēng)性抑制RNAi效應(yīng)。

4 RNAi的應(yīng)用及前景

4.1遺傳學(xué)研究的應(yīng)用

4.1.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)座子RNAi缺陷可引起內(nèi)源性轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)。轉(zhuǎn)座子的重要特征之一是具有反向重復(fù)序列，生物體通過此序列可以產(chǎn)生dsRNA發(fā)夾，啟動(dòng)PTGS效應(yīng)，所以抑制轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)有利于遺傳穩(wěn)定，防止遺傳損害。因此人們認(rèn)為RNAi的一個(gè)自然功能就是轉(zhuǎn)座子沉默[8]。

4.1.2 基因功能分析人類基因組計(jì)劃中的基因測(cè)序已經(jīng)完成，人類將進(jìn)入后基因組時(shí)代。其主要任務(wù)是確定基因的功能，因此迫切需要建立有效、經(jīng)濟(jì)的分析基因的技術(shù)。

盡管目前對(duì)RNAi機(jī)制并未完全弄清，但其高效、特異阻斷基因的表達(dá)已在某些研究中開展。RNAi克服了傳統(tǒng)基因功能分析技術(shù)要求高，過程繁等缺點(diǎn)，已吸引了越來越多學(xué)者的重視。可以預(yù)見，RNAi將成為新一代基因組功能研究的有力工具。

4.2 臨床應(yīng)用

4.2.1 抗病毒David等認(rèn)為在動(dòng)物中RNAi代表一種古老的抗病毒反應(yīng)，與植物的PTGS（轉(zhuǎn)錄后的基因沉默）一樣可抵抗病毒的感染，目前這一觀點(diǎn)已被普遍認(rèn)可。

目前，利用體外培養(yǎng)人類細(xì)胞研究抗病毒感染，主要限于單鏈 RNA病毒，包括人類免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰質(zhì)炎病毒等。Novina[9]等用針對(duì)CD4的siRNA轉(zhuǎn)染Magi-CCR5細(xì)胞，產(chǎn)生了對(duì)CD4受體表達(dá)特異性抑制達(dá)75%，Northern雜交發(fā)現(xiàn)CD4分子的mRNA明顯降低了8倍，從而阻斷了HIV-1病毒細(xì)胞。Kapadie等[10]用針對(duì)HCV的siRNA與表達(dá)HCV的質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染人的肝癌細(xì)胞株Huh-7細(xì)胞，2 d后，Northern雜交檢測(cè)顯示：HCV的RNA含量下降，證明了HCV特異的siRNA抑制了病毒的復(fù)制[9]。

RNAi在針對(duì)其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰質(zhì)炎病毒，豬瘟病毒等均顯示出抑制病毒復(fù)制的作用。最近有文獻(xiàn)報(bào)道RNAi在研制抗SARS藥物中顯示出特殊的作用。

從當(dāng)前的這些研究結(jié)果可以看出，siRNA通過序列特異性干擾作用，能封閉病毒基因在體內(nèi)的復(fù)制，RNAi成為控制病毒在細(xì)胞內(nèi)復(fù)制的重要工具，為病毒治療提供了新的思路。

4.2.2 抗腫瘤利用RNAi的高效率和高度特異性，我們可以設(shè)計(jì)特異siRNA分子，沉默目標(biāo)基因，而正常基因不受影響。這是用RNAi抗腫瘤的基本思路。從現(xiàn)階段研究的進(jìn)展看來，RNAi有望成為新一代研究抗腫瘤的重要工具，發(fā)揮重要作用。

腫瘤是多因素、多基因的疾病，單個(gè)癌基因的抑制難以達(dá)到治療效果，用基因敲除等方法進(jìn)行治療研究就造成了時(shí)間和經(jīng)費(fèi)的浪費(fèi)。RNAi技術(shù)可同時(shí)抑制多個(gè)基因，且抑制效果互不干擾，并且RNAi識(shí)別可以精確到單個(gè)核苷酸，對(duì)由野生型突變形成的癌基因，如ras、p53等，能產(chǎn)生準(zhǔn)確有效的封閉效果，而野生型不受影響[11]。Wilda等針對(duì)bcr/abl基因融合位點(diǎn)設(shè)計(jì)了一段21 nt長(zhǎng)的dsRNA分子，特異性沉默了該融合基因，并使表達(dá)該融合基因的細(xì)胞凋亡，而對(duì)不表達(dá)該基因的腫瘤無任何作用。最近，Linsl等把針對(duì)bcl2基因的mRNA-cDNA雜交體轉(zhuǎn)染到人前列腺癌lncap細(xì)胞中，產(chǎn)生了長(zhǎng)時(shí)期的阻抑bcl2表達(dá)效應(yīng)，這一效應(yīng)與體外培養(yǎng)的前列腺癌細(xì)胞中的RNAi非常相似。

5 結(jié)語

RNAi的發(fā)現(xiàn)改變了人們對(duì)細(xì)胞基因調(diào)控的傳統(tǒng)思路，提供了特異性阻斷基因表達(dá)的新工具和評(píng)價(jià)基因功能的新策略，為人類基因功能研究和疾病基因治療開辟了一條革命性的新領(lǐng)域。盡管其機(jī)制仍未完全弄清，但RNAi技術(shù)在病毒、腫瘤等尚未根治的疾病提供了新的治療方案，并帶來根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已經(jīng)日新月異，可以相信，不久的將來，將會(huì)出現(xiàn)基于RNAi的基因治療藥物，RNAi技術(shù)也將成為未來生命研究的重要工具。

[參考文獻(xiàn)]

[1]康潔，劉福林．RNAi的抗病毒作用及其機(jī)制[J]．現(xiàn)代免疫學(xué)，2004，24（5）：439-441.

[2]Lipardi C，Wei Q，Paterson BM.RNAi as random degradative PCR： siRNA primers convert mRNA into dsRNAs that are degraded to generate new siRNAs[J]． Cell， 2001，107（3）：297-307.

[3]朱汝森，劉新光，梁念慈． RNAi實(shí)現(xiàn)策略的進(jìn)展[J]． 國(guó)外醫(yī)學(xué)臨床生物化學(xué)與檢驗(yàn)學(xué)分冊(cè)，2005，25（3）：214-215.

[4]Nykanen A，Haley B，Zamore PD．ATP requirements and small interfering RNA structure in the RNA interference pathway[J]．Cell，2001，107（3）：309-321.

[5]Harborth J，Elbashir SM，Becheft K，et al．Identification of essential genes in cultured mammalian cells using small interfering RNAs[J]．Cell Science，2001，114（24）：4557.

[6]Elbashir SM，Harborth J，Lendeckel W，et al． Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]． Nature，2001，411（6836）：494-498.

[7]Bass BL．RNA interference．The short answer[J]．Nature，2001，411（6836）：428-429.

[8]Vastenhouw NL，F(xiàn)ischer SE，Robert VJ，et al． A genome-Wide Screen identefies 27 genes involved in transposon silencing in C.elegans[J]． Curr Biol，2003，13（15）：1311-1316.

[9]Peng HJ， Tsai LC， Su SN， et al． Comparison of different adjuvants of protein and DNA vaccination for the prophylaxis of IgE antibody formation[J]． Vaccine， 2004，22：:756.

[10]Kumar M，Behera AK， Hu J，et al． IFN-grmma and IL-12 plasmid DNA as vaccine adjuvant in a murine model of grass allergy[J]． Allergy Clin Immunol，2001，108：402.

[11]陳競(jìng)． RNAi的研究進(jìn)展[J]．川北醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2004，19（3）:198.

(收稿日期:2007-08-23)

基因治療的基本策略范文4

[關(guān)鍵詞] 地中海貧血；孕期；預(yù)防與治療

[中圖分類號(hào)] R556.6[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼]A [文章編號(hào)]1673-7210（2009）01（b）-030－03

The study of mediterranean anemia for screening methods and prevetion and treatment during pregnance

WANG Zhi-hui

(The MCH Hospital of Haizhu District, Guangzhou City, Guangdong Province， Guangzhou510000, China)

[Abstract] Objective: To evaluate the value of the screening methods and the preventions and treatment of mediterranean anemia in pregnant women. Methods: Choosing 700 out-patients from 2005 to 2007 who participated in examination before delivery. Then divided them into three groups refering to the level of Hb. After being given vitamins and folic acid and regulated the food patients take. Checked the biochemiacal exams after 3 weeks. Results: The MCV and MCH in mediterranean anemia group(MA) were significant lower than controlled group and non-MA group (P

[Key words] Mediterranean anemia; Pregnant period; Prevention and treatment

地中海貧血(mediterranean anemia)是一組遺傳性溶血性貧血，其共同特點(diǎn)是由于珠蛋白基因的缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，導(dǎo)致血紅蛋白的組成成分改變[1]。地中海貧血不僅是一種發(fā)病率較高的血液系統(tǒng)疾病，而且全球約18億人為無明顯癥狀的攜帶者，每年出生100萬缺陷患兒，在我國(guó)，地中海貧血的高發(fā)區(qū)位于南方各省份。地中海貧血與妊高征、流產(chǎn)、畸胎及死胎的發(fā)生有相關(guān)關(guān)系，嚴(yán)重影響了優(yōu)生優(yōu)育，因此早期預(yù)防，及時(shí)進(jìn)行臨床干預(yù)是非常有必要的[2]。本研究提選擇2005年1月～2007年1月在我院婦產(chǎn)科門診進(jìn)行常規(guī)定期產(chǎn)前檢查，首次產(chǎn)前篩查，確診為地中海貧血的患者病歷共700例，進(jìn)行為期2周的臨床干預(yù)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1資料與方法

1.1一般資料

選取2005年1月～2007年1月在我院婦產(chǎn)科門診進(jìn)行常規(guī)定期產(chǎn)前檢查、孕28周前在本院常規(guī)產(chǎn)檢并住院分娩病例共700例。依據(jù)首次產(chǎn)前檢查時(shí)血常規(guī)及血紅蛋白結(jié)果分為3組：Hb>100 g/L及血紅蛋白電泳正常者185例作為對(duì)照組；Hb

其中，地貧組240例均囑男方查血細(xì)胞分析及血紅蛋白電泳，如雙方為同型地貧，則需基因診斷，孕婦α地貧組164例，其中，男方同型4例地貧，2例同為（4，2）型缺失雜合子，（－－/aa），2例同為1基因缺失雜合子，即標(biāo)準(zhǔn)型α地貧。均孕24、28周彩超排除巴氏水腫胎。孕婦β地貧組76例，β及α地貧組2例，男方均無同型地貧，可以排除胎兒重度地貧，不需進(jìn)一步檢查胎兒臍帶血。

1.2檢測(cè)方法

1.2.1血細(xì)胞分析用SystemKX-21自動(dòng)血細(xì)胞分析儀(日本產(chǎn))檢測(cè)血常規(guī)，包括紅細(xì)胞計(jì)數(shù)(RBC)、血紅蛋白濃度(Hb)、紅細(xì)胞平均容積(MCV)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)、紅細(xì)胞平均血紅蛋白濃度(MCHC)等15項(xiàng)。

1.2.2血紅蛋白電泳美國(guó)Helena公司的SPLFECOMBO血紅蛋白電泳儀，做HbA2定量測(cè)定，異常Hb測(cè)定、HbF定量測(cè)定及不穩(wěn)定Hb檢查。血紅蛋白電泳篩查指標(biāo)：HbA2正常范圍為2.5%～3.5%，HbF正常范圍為0.5%～2%。

1.2.3基因診斷對(duì)篩查陽(yáng)性的α地貧和β地貧攜帶者采用地貧診斷基因芯片(Thala Chip)進(jìn)行地中海貧血的檢測(cè)，由深圳亞能生物技術(shù)公司提供基芯片及技術(shù)支持。Thala Chip有24個(gè)探針，可同時(shí)檢測(cè)－－SEA、－α3.7、－α4.2 3種常見缺失型α珠蛋白基因和21種β珠蛋白基因的突變。用常規(guī)方法提取患者DNA，通過PCR技術(shù)和PCR結(jié)合反向點(diǎn)雜交（RDB）技術(shù)擴(kuò)增α珠蛋白基因或β珠蛋白基因含突變點(diǎn)DN段，瓊脂糖凝膠電泳鑒定PCR產(chǎn)物。根據(jù)DNA標(biāo)記反應(yīng)和雙鏈雜交反應(yīng)的特異性，針對(duì)野生型及不同突變型設(shè)計(jì)特異性雜交探針，然后用特異性熒光染料標(biāo)記PCR產(chǎn)物。將標(biāo)記產(chǎn)物和雜交液混合，與玻片上的探針進(jìn)行雜交，洗滌后用熒光掃描儀掃描玻片，根據(jù)雜交結(jié)果顯示探針的位置及熒光類型判斷野生型或不同的突變位點(diǎn)。本研究采用基因診斷確診為輕型地中海貧血者為地貧組。

1.3臨床處理

地貧組孕28周及孕32周予補(bǔ)充葉酸、維生素E、復(fù)合維生素B，各2周，并指導(dǎo)孕婦均衡飲食。孕足月入院待產(chǎn)時(shí)復(fù)查血常規(guī)RBC、Hb、MCV、MCH。

1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

將收集到的數(shù)據(jù)輸入計(jì)算機(jī)建立EXCEL數(shù)據(jù)庫(kù)，用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和分析。統(tǒng)計(jì)方法采用秩和檢驗(yàn)和χ2檢驗(yàn)。P

2結(jié)果

依據(jù)首次產(chǎn)前檢查時(shí)血常規(guī)及血紅蛋白結(jié)果分為3組，孕婦的血細(xì)胞分析結(jié)果見表1。

表1 各組孕婦的血細(xì)胞分析結(jié)果比較

表中除對(duì)照組和非地貧組的MCH外，各參數(shù)在各組間差異均有顯著性差異(P

在給予孕28周及孕32周的地貧組予補(bǔ)充葉酸、維生素E、復(fù)合維生素B，各2周，并指導(dǎo)孕婦均衡飲食，兩周之后再次復(fù)查血常規(guī)RBC、Hb、MCV、MCH結(jié)果見表2。

表2 地貧組予補(bǔ)充葉酸、維生素E、復(fù)合維生素B后

與先前的血常規(guī)比較

由表2可見，在給予葉酸、維生素E、復(fù)合維生素B后，28周及孕32周的地貧組孕在血常規(guī)RBC、Hb、MCV、MCH與初檢時(shí)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P

3討論

3.1地中海貧血的概況

地中海貧血(mediterranean anemia)也稱海洋性貧血（Thalassemia）、珠蛋白合成障礙性貧血、庫(kù)勒（Cooley）貧血。1925年Thomas Cooley和Pear Lee首次描述這種發(fā)生在意大利兒童的遺傳性、溶血性貧血病，按受累基因、血紅蛋白鏈位置分為α、β、γ和δ等4種類型，其中以β和α地中海貧血較為常見，廣泛發(fā)生于熱帶和亞熱帶國(guó)家，我國(guó)以長(zhǎng)江以南發(fā)病率高，無明顯癥狀的攜帶者超過人群的20%[3]。

地中海貧血是一組常染色體不完全顯性遺傳性慢性溶血性疾病，是因珠蛋白基因缺陷使血紅蛋白中的珠蛋白肽鏈有一種或幾種合成減少或不能合成，引起血紅蛋白的組成成份發(fā)生改變而導(dǎo)致的溶血性疾病。

重型地貧胎兒基本不能妊娠至足月，大多在妊娠28～34周胎死宮內(nèi)、死產(chǎn)或出生后不久夭折，不能長(zhǎng)大成人，故臨床上成年地貧患者均為輕型，輕型地中海貧血常無臨床癥狀，其外周血中RBC和Hb也可以是正常的[4]。目前，臨床上篩查輕型地中海貧血的方法主要有血紅蛋白電泳、紅細(xì)胞脆性檢測(cè)等。近些年來文獻(xiàn)報(bào)道輕型地貧患者外周血中RBC、MCV、MCH等血細(xì)胞參數(shù)發(fā)生明顯變化，而且有診斷意義[5]。隨著臨床檢驗(yàn)技術(shù)的提高，基因診斷的出現(xiàn)很大程度提高了地貧診斷的準(zhǔn)確性。

3.2地中海貧血的預(yù)防

自20世紀(jì)70年代后期以來，在歐洲、中東和地中海的一些地區(qū)開展了高危人群地貧的前瞻性篩查，對(duì)象主要為育齡婦女及其配偶。Cao等[6]在地中海地區(qū)進(jìn)行了近20年的地貧遺傳預(yù)防計(jì)劃，已經(jīng)取得顯著的效果。Hsia等[7]在夏威夷實(shí)施了控制地貧計(jì)劃，包括對(duì)高危人群進(jìn)行篩查、教育公眾重視地貧的預(yù)防方法、采用最優(yōu)的篩查策略等。在我國(guó)南方，地貧是發(fā)病率高、影響較大的疾病之一。如廣東的地貧檢出率為1.08%～1.16%，廣西和海南更高。地貧的預(yù)防最關(guān)鍵要從婚檢著手。

3.3地中海貧血的治療

目前地中海貧血還沒有很高效的治療方法，在臨床上常用的方法可以分為兩大類：藥物治療和基因矯正。藥物治療包括早期的5-氮胞苷、羥基脲和丁酸鹽類藥物。基因矯正包括補(bǔ)償策略的珠蛋白基因治療以及造血干細(xì)胞移植治療。

本研究在臨床確診的基礎(chǔ)上，結(jié)合患者的初診的血常規(guī)和血紅蛋白分析，在孕期通過補(bǔ)充葉酸、維生素E、復(fù)合維生素B，各2周。葉酸、維生素E、復(fù)合維生素B是骨髓造血與修復(fù)所必需的物質(zhì)，同時(shí)指導(dǎo)孕婦均衡飲食，攝入機(jī)體必需的微量元素與營(yíng)養(yǎng)。通過以上的臨床干預(yù)臨床癥狀得到改善，并且也為優(yōu)生優(yōu)育奠定了基礎(chǔ)。

[參考文獻(xiàn)]

[1]Souillet G. Indications and results of progenitor cell transplant in congenital haemopathies except Fanconi anaemia[J].BMT,2002,21(Suppl2):S28-S33.

[2]Cai R, Lir J, Wang L, et al. Study on molecular epidemiology of the alpha-thalassemias in Liuzhoou City[J]. Hemoglobin,2004,9（28）:325-333.

[3]Rogers M, Phelan L, Bain B. Screening criteria for beta-thalassemia trait in pregnant women[J].J Clin Pathol,2003,48(11):1054.

[4]何冰.妊娠合并地中海貧血的篩查和產(chǎn)前診斷[J].實(shí)用婦產(chǎn)科雜志,2003,19(3):1361.

[5]Lahiri DK, Schuabel B.DNA isolation by a rapid method from human blood samples: Effects of MgCl2, EDTA, storage time, and temperature on DNA yield and quality[J].Biochem Genet,2001,31(18):3212-3281.

[6]Cao A, Saba L, Galanello R, et al. Molecular diagnosis and carrier screening for thalassemia[J].JAMA,2001,278(15):1273-1277.

基因治療的基本策略范文5

[關(guān)鍵詞] 冠狀動(dòng)脈；支架；再狹窄；研究進(jìn)展

[中圖分類號(hào)] R541.4 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-4721（2013）08（b）-0029-03

冠狀動(dòng)脈支架置入術(shù)自20世紀(jì)80年代應(yīng)用于臨床以來，得到了迅猛的發(fā)展，并已經(jīng)成為心肌血運(yùn)重建的主要手段，但支架置入術(shù)后仍有10%～50%[1]的患者發(fā)生支架內(nèi)再狹窄（in-stent restenosis，ISR），以術(shù)后3～6個(gè)月為高峰期，6個(gè)月后的發(fā)生率明顯降低，這嚴(yán)重影響了支架置入術(shù)的療效和患者的長(zhǎng)期預(yù)后。因此，解決支架內(nèi)再狹窄是當(dāng)今冠心病介入治療領(lǐng)域的難點(diǎn)與重點(diǎn)之一[2]。

ISR是指支架置入術(shù)后6～9個(gè)月冠狀動(dòng)脈造影發(fā)現(xiàn)其管腔凈丟失率≥50%。Mehran等[3]利用血管內(nèi)超聲顯像技術(shù)（intravascular ultrasound，IVUS），將ISR分為4型，Ⅰ型：局限病變型，位于支架內(nèi)或支架邊緣，病變長(zhǎng)度10 mm，但不超過支架的邊緣；Ⅲ型：增生型，病變長(zhǎng)度>10 mm并超過支架的邊緣；Ⅳ型：完全閉塞型，造影劑不能通過。

1 ISR的病理學(xué)

支架置入所致的急性血管損傷程度決定新生內(nèi)膜增生的程度。研究表明[4]，由于支架置入使病變血管擴(kuò)張而引起血管內(nèi)皮的損傷，血管彈性層的破壞進(jìn)而延伸到動(dòng)脈外膜，血管的損傷導(dǎo)致血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）向損傷部位遷移增殖以及血栓的形成，從而引起ISR。而IVUS研究表明，ISR則完全是新生內(nèi)膜的結(jié)果[5-7]，而新生內(nèi)膜主要是由增殖的VSMC和細(xì)胞外基質(zhì)組成[8]。血管壁重構(gòu)在時(shí)間上分兩個(gè)階段，其作用也是雙向性的：早期是適應(yīng)性重構(gòu)，大約距支架置入1～2個(gè)月，此時(shí)內(nèi)膜組織增生并不壓迫支架改變其內(nèi)徑且能在一定程度上減輕支架置入后管腔橫截面積的丟失；晚期主要發(fā)生在支架置入6個(gè)月以后，血管壁重構(gòu)的程度與血管損傷輕重相關(guān)，會(huì)加重血管壁的硬化并引起ISR。

ISR的形成可分為以下幾個(gè)過程[9]：①支架置入后，血小板在支架表面的聚集和激活導(dǎo)致血栓的形成；②接下來的幾天到數(shù)周，大量白細(xì)胞聚集在血管損傷部位并分泌細(xì)胞因子對(duì)治愈的組織產(chǎn)生影響；③炎癥反應(yīng)階段，可能持續(xù)幾個(gè)月，在這個(gè)過程中血管壁將重新組織，VSMC發(fā)生增殖反應(yīng)，導(dǎo)致新生內(nèi)膜大量增生從而引起ISR。

2 ISR的機(jī)制

ISR的發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，一般認(rèn)為由多因素參與。目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為，ISR是一個(gè)損傷反應(yīng)后新生內(nèi)膜增殖與血管重構(gòu)的過程，其中血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷及炎癥反應(yīng)是ISR的啟動(dòng)因素，VSMC的過度增殖與遷移，血管新生內(nèi)膜的過度增生是其形成的中心環(huán)節(jié)[10]，并且血栓形成也起一定的作用。

2.1 血小板激活血栓形成

無論是球囊預(yù)擴(kuò)張還是支架置入，都可能造成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊與正常組織連接部位的破裂，并可深達(dá)中層，使內(nèi)皮組織暴露并造成抗凝因子的釋放，如一氧化氮、前列腺素等，激活血小板并形成血栓，5～7 d附壁血栓達(dá)到高峰。研究表明，支架置入后最有可能刺激血栓形成的是組織因子的暴露[11]，血小板活化后可釋放諸如血小板源性生長(zhǎng)因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等，刺激中層VSMC的遷移和增殖，導(dǎo)致一系列血管損傷后的修復(fù)反應(yīng)，引起血管狹窄。

2.2 炎癥反應(yīng)

Kornowski等[4]觀察到血管損傷程度和炎癥反應(yīng)程度明顯相關(guān)，炎癥反應(yīng)程度又與新生內(nèi)膜增生程度明顯相關(guān)。球囊擴(kuò)張和支架置入損傷血管內(nèi)膜，并且支架作為異物必定會(huì)引起機(jī)體的免疫應(yīng)答，特別是支架損傷血管中膜層后[12]，循環(huán)中的炎性細(xì)胞如T淋巴細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞，遷移并黏附于損傷部位，引起冠狀動(dòng)脈炎癥。而且支架置入后持久牽拉血管，可導(dǎo)致血管中層持久的慢性炎癥反應(yīng)，刺激內(nèi)膜增生[13]。實(shí)際上炎癥細(xì)胞尤其是巨噬細(xì)胞在ISR的各個(gè)階段都能觀察到。炎癥可能是ISR發(fā)生的重要機(jī)制[14]。

2.3 血管內(nèi)膜增生與血管重構(gòu)

目前公認(rèn)的ISR主要原因是置入支架局部的內(nèi)膜過度增生[15]，一直認(rèn)為內(nèi)膜剝脫、中膜損傷后平滑肌細(xì)胞過度增殖、遷移，是ISR病理改變的主要環(huán)節(jié)，故平滑肌細(xì)胞是增生內(nèi)膜的主要成分。對(duì)支架而言，內(nèi)膜增生分布于其全長(zhǎng)，程度基本均等，僅在支架中心部位稍明顯，但未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。支架置入后的內(nèi)膜增生并不只限于支架內(nèi)表面，在支架外表面和血管壁支架也可有內(nèi)膜組織的增生，并且可以影響支架置入部位血管壁重構(gòu)的過程。ISR形成的晚期主要是由血管壁中層大量纖維組織增生引起的血管重構(gòu)。血管重構(gòu)包括負(fù)性重構(gòu)和正性重構(gòu)，ISR是由負(fù)性重構(gòu)引起的。

3 ISR的影響因素

3.1 年齡

年齡每增加10歲，發(fā)生ISR的相對(duì)危險(xiǎn)度增加1.14，而據(jù)Kasaoko等[16]報(bào)道年齡每增加10歲，受損血管處發(fā)生狹窄的相對(duì)危險(xiǎn)性增加14%～19%。

3.2生活方式

吸煙是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因子，參與并加速了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生及發(fā)展。Sahara等[17]的研究發(fā)現(xiàn)，吸煙者發(fā)生局灶性冠狀動(dòng)脈ISR和彌漫性ISR的比率高達(dá)76%～85%，但新的研究卻顯示，吸煙與ISR關(guān)系不大[18]。Niroomand等[19]研究表明，每周飲酒≥50 g的患者較每周飲酒

3.3代謝因素

胰島素依賴型糖尿病是支架置入術(shù)后ISR發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[16，20]，這可能是由于胰島素抵抗致內(nèi)皮功能不全并導(dǎo)致平滑肌細(xì)胞增殖，造成冠狀動(dòng)脈內(nèi)膜增生，導(dǎo)致ISR的發(fā)生。有報(bào)道稱，高尿酸血癥亦與ISR有關(guān)[21]

3.4冠狀動(dòng)脈病變相關(guān)因素

國(guó)內(nèi)陳韻岱等[22]認(rèn)為，左前降支、開口病變是預(yù)測(cè)ISR的危險(xiǎn)因素。冠狀動(dòng)脈ISR發(fā)生率與原血管病變長(zhǎng)度、大小呈正相關(guān)[18，23]，可以將10 mm病變長(zhǎng)度作為ISR的一個(gè)高危界限。同時(shí)在小血管（血管直徑

3.5置入支架相關(guān)因素

一次置入多個(gè)支架是ISR的顯著危險(xiǎn)因素[24]，30 mm的長(zhǎng)病變[22]，以及因ISR而在此再次置入支架者，其ISR發(fā)生率很高。

3.6 與介入操作相關(guān)的因素

①術(shù)者對(duì)支架及支架長(zhǎng)度的選擇；②經(jīng)球囊高壓擴(kuò)張，但置入支架的對(duì)稱性不好；③冠狀動(dòng)脈旁路移植手術(shù)后在移植橋血管內(nèi)置入支架；④置入支架時(shí)無IVUS指導(dǎo)；⑤兩次介入的操作時(shí)間間隔≤90 d。

4 ISR的防治對(duì)策

對(duì)于ISR，除了改變不良生活習(xí)慣、加強(qiáng)口服藥物治療，臨床上也出現(xiàn)了一些新的技術(shù)用于ISR的預(yù)防和治療，諸如切割球囊、定向冠狀動(dòng)脈斑塊旋切術(shù)、基因治療及放射治療等。

4.1盡可能減少ISR的危險(xiǎn)因素

冠狀動(dòng)脈病變患者的臨床特點(diǎn)及病變的臨床特征是無法改變的，臨床醫(yī)生應(yīng)盡量嚴(yán)格掌握手術(shù)適應(yīng)證并根據(jù)病變選擇合適的支架，術(shù)中盡量減少血管內(nèi)膜的損傷。

4.2 口服藥物治療

血管緊張素受體拮抗劑具有保護(hù)內(nèi)皮功能，抑制平滑肌細(xì)胞增生和向內(nèi)膜遷移，阻止新生內(nèi)膜增生，從而延緩和抑制ISR的血管壁增厚，改善損傷反應(yīng)的形成。他汀類藥物除降脂作用外，還有抗炎、抗增殖、抗氧化應(yīng)激、抑制新生血管形成等多重作用，保護(hù)受損血管內(nèi)皮細(xì)胞，干預(yù)ISR的多個(gè)環(huán)節(jié)，是可以用于降低ISR的發(fā)生率[25]。另有小規(guī)模的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床研究證實(shí)口服雷帕霉素可以降低冠狀動(dòng)脈金屬裸支架置入后的再狹窄率[26]，但尚未得到大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)的證實(shí)。

4.3 藥物涂層支架

藥物涂層支架（drug eluting stent，DES）是將抗血栓和抗增殖藥物包被于冠狀動(dòng)脈支架上，置入冠狀動(dòng)脈后藥物在局部以“洗脫”方式緩慢釋放，既增加局部藥物濃度，又減少全身不良反應(yīng)，從而降低再狹窄率[27]。①抗血栓藥物以肝素膜為代表，主要作用是降低血栓的發(fā)生，據(jù)報(bào)道可使支架置入后ISR降到12%～22%[28]；②抗增殖藥物以雷帕霉素和紫杉醇為代表，雷帕霉素抑制細(xì)胞從G1期向S期過渡，而紫杉醇可使細(xì)胞發(fā)育受阻于M期，均可以一直VSMC的增殖，減少再狹窄的發(fā)生。大規(guī)模臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)此兩種藥物涂層支架均可明顯降低支架置入后ISR。

4.4 內(nèi)皮細(xì)胞種植

內(nèi)皮細(xì)胞種植能在較短的時(shí)間內(nèi)使受損的血管壁重新內(nèi)皮化，迅速恢復(fù)內(nèi)皮細(xì)胞的完整性及其生物學(xué)功能，維護(hù)了血管局部的正常生理環(huán)境，能夠減少急性、亞急性血栓形成和再狹窄的發(fā)生。

4.5 基因治療

基因治療被認(rèn)為是防止ISR較理想的方法，主要是把帶有細(xì)胞毒性基因、細(xì)胞穩(wěn)定基因、抗遷移基因的支架置入病變處，可抑制VSMC增殖和遷移并促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生及血栓溶解。用于防止ISR的基因主要分為5類[28]：①抗血栓形成的基因；②血管活性物質(zhì)的基因；③生長(zhǎng)因子的基因；④癌基因與抑癌基因；⑤細(xì)胞周期調(diào)節(jié)基因。

4.6 切割球囊

切割球囊被證明能有效防治ISR，臨床應(yīng)用有效而安全。Chen等[29]根據(jù)IVUS檢查發(fā)現(xiàn)切割球囊主要機(jī)制是顯著減少斑塊面積但對(duì)血管面積無明顯增加，這提示它對(duì)血管的損傷小，是其降低ISR的主要機(jī)制。

4.7 冠狀動(dòng)脈內(nèi)放射治療

冠狀動(dòng)脈內(nèi)放射治療（intracoronary radiation therapy，ICRT）由導(dǎo)管介導(dǎo)，將β射線源或γ射線輸送到靶血管，借助電離輻射的作用來干預(yù)血管成形術(shù)后的病理生理反應(yīng)，降低ISR。主要作用機(jī)制是抑制VSMC的遷移，誘導(dǎo)平滑肌細(xì)胞出現(xiàn)G1期阻滯，進(jìn)而抑制其增殖，從而減少內(nèi)膜增生。

4.8 斑塊消融治療

斑塊消融技術(shù)可以清除支架置入術(shù)后的殘余斑塊及新生內(nèi)膜組織，在理論上是有效的，但都是與單純PTCA相比較的結(jié)果，并沒有與支架置入術(shù)后進(jìn)行對(duì)照。目前應(yīng)用較多的有定向冠狀動(dòng)脈斑塊切除術(shù)（directional coronary atherectomy，DCA）、冠狀動(dòng)脈斑塊旋磨術(shù)（rotablata）、冠狀動(dòng)脈內(nèi)激光成形術(shù)（excimer laser coronary angioplasty，ELCA）等。

4.9 超聲治療

已有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，超聲可抑制平滑肌細(xì)胞的黏附、遷移和增生，從而干預(yù)損傷血管修復(fù)過程，防止平滑肌細(xì)胞的過度增生[30]。但其對(duì)ISR的防治作用，仍有待于進(jìn)一步研究。

4.10 再次支架置入

支架內(nèi)支架可以得到良好的影像學(xué)結(jié)果，是一種安全有效的治療ISR策略，其遠(yuǎn)期療效也令人滿意[31]。

5 小結(jié)

綜上所述，ISR是一個(gè)十分復(fù)雜的問題，近年來隨著對(duì)ISR發(fā)生機(jī)制的深入研究，各種針對(duì)其發(fā)病機(jī)制的防治措施不斷發(fā)展。DES的出現(xiàn)曾一度使冠狀動(dòng)脈介入治療領(lǐng)域看到了消除ISR的希望，但近年來隨著DES的廣泛應(yīng)用，特別是在左主干、分叉病變及小血管的應(yīng)用，發(fā)現(xiàn)其ISR也在逐漸增高。目前，在患者規(guī)律口服藥物治療、術(shù)中盡量減少ISR的危險(xiǎn)因素的同時(shí)，一旦發(fā)生ISR，應(yīng)用何種治療方法最有效且長(zhǎng)期療效如何，仍需要大規(guī)模的臨床實(shí)驗(yàn)提供循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。相信，隨著新藥物的臨床應(yīng)用、新技術(shù)的不斷進(jìn)步以及新一代支架的問世，ISR這個(gè)困擾冠狀動(dòng)脈介入治療領(lǐng)域的難題終將被攻克。

[參考文獻(xiàn)]

[1] Garza L，Aude YW，Saucedo JF.Can we prevent in-stent restenosis？[J].Curr Opin Cardiol，2002，17（5）：518-525.

[2] Schwartz RS，Henry TD.Pathophysiology of coronary artery restenosis[J].Rev Cardiovasc Med，2002，3（suppl 5）：S4-S9.

[3] Mehran R，Dangas G，Abizzaid AS，et al. Angiographic patterns of in-stent restenosis： classification and implications for long-term outcome [J].Circulation，1999，100（18）：1872-1878.

[4] Kornowski R，Hong MK，Tio FO，et al.In-stent restenosis：contributions of inflammatory response and arterial injury to neointimal hyperplasia[J]. J Am Coll Cardiol，1998，31（1）：224-230.

[5] Mach F.Toward new therapeutic strategies against neointimal formation in restenosis[J].Atheroscler Thromb Vasc Biol，2000，20（7）：1669.

[6] Mudra H，Regar E，Klauss V，et al. Serial follow-up after optimized ultrasound-guided deployment of Palmaz-Schatz stents. In-stent neointimal proliferation without significant reference segment response[J]. Circulation，1997，95（2）：363-370.

[7] Hoffman R，Minta GS，Dussaillant RG，et al. Patterns and mechanisms of in-stent restenosis：a serial intravascular ultrasound study[J].Circulation，1996，94（6）：1247-1254.

[8] Virmani R，F(xiàn)arb A. Pathobiologic of in-stent restenosis[J].Curr Opin Lipidol，1999，10（6）：499-506.

[9] Edelman ER，Rogers C.Pathobiologic response to stenting[J].AM J Cardiol，2008，81（7A）：4E-6E

[10] Weintraub WS.The pathophysiology and burden of restenosis[J]. Am J Cardiol，2007，100（5A）：3K-9K.

[11] Speidel CM，Eisenberg PR，Ruf W，et al.Tissue factor mediates prolonged procoagulant activity on the luminal surface of balloon-injured aortas in rabbits[J].Circulation，1995，92（11）：3323-3330.

[12] Farb A，Sangiorgi G，Carter A J，et al.Pathology of acute and chronic coronary stenting in humans[J].Circulation，1999，99（1）：44-52.

[13] Van Beusekon HMM，Whelan DM，Hofma SH，et al.Stent but not balloon angioplasty induce chronic neointimal permeability[J].Circulation，1995，92（Suppl）：1-87.

[14] 李建軍.炎癥可能是支架內(nèi)再狹窄發(fā)生的重要機(jī)制[J].中華心血管病雜志，2009，37（3）：210-212.

[15] Glover C，Ma X，Chen YX，et al.Human in-stent restenosis tissue obtained by means of coronary atherectomy consists of an abundant proteoglycan matrix with a paucity of cell proliferation[J].Am Heart J，2002，144（4）：702-709.

[16] Kasaoko S，Tobis JM，Akiyama T，et al.Angiography and intravascular ultrasound predictors of in-stent restenosis[J]. J Am Coll Cardiol，1998，32（6）：1630-1635.

[17] Sahara M，Kirigaya H，Oikawa Y，et al. Arterial remodeling patterns before intervention predict diffuse in-stent restenosis： an intravascular ultrasound study[J].J Am Coll Cardiol，2003，42（10）：1731-1738.

[18] Singh M，Gersh BJ，Mcelelland RL，et al.Predictive factors for ischemic target vessel revascularization in the prevention of restenosis with tranilast and its out-comes trial[J]. J Am Coll Cardiol，2005，45（2）：198-203.

[19] Niroomand F，Heauer O，Tiefenbacher C，et al. Influence of alcohol consumption on restenosis rate after percutaneous transluminal coronary angioplasty and stent implation[J].Heart，2004，90（10）：1189-1193.

[20] 侯青，喬樹賓，高潤(rùn)霖，等.冠狀動(dòng)脈支架術(shù)后再狹窄的預(yù)測(cè)因素[J].中華心血管病雜志，2005，33（增刊）：61-64.

[21] 胡健，沈衛(wèi)峰，張建盛，等.冠狀動(dòng)脈內(nèi)支架置入術(shù)后在狹窄與尿酸的關(guān)系[J].中華心血管病雜志，2002，30（增刊）：270.

[22] 陳韻岱，呂樹錚，張金榮，等.冠狀動(dòng)脈支架再狹窄預(yù)測(cè)因素的探討[J].中國(guó)介入心臟病學(xué)雜志，2000，8（1）：13-14.

[23] Albertal M，Abizaid A，Munoz JS，et al.A novel mechanism explaining early lumen loss following balloon angioplasty for the treatment of in-stent restenosis[J]. Am J Cardiol，2005，95（3）：751-755.

[24] Caxiela E，Vliestra RE，Browne KF，et al.Six-month follow up of patients with multiple stents in a single coronary artery[J].J Am Coll Cardiol，1997，29（Suppl A）：276.

[25] 鄒佳妮，樊光輝.他汀類藥物干預(yù)支架內(nèi)再狹窄的研究進(jìn)展[J].華南國(guó)防醫(yī)學(xué)雜志，2010，24（5）：424-427.

[28] 李靜，華琦.口服雷帕霉素預(yù)防冠脈支架內(nèi)再狹窄[J].臨床藥物治療雜志，2010，8（2）：26-31.

[27] Fattori R，Piva T.Drug-eluting stents in vascular in intervention[J].Lancet，2003，361（9353）：247-249.

[28] Vrolix MCM，Legrand VM，Reiber JHC，et al.Heparin-coated wiktor stents in human coronary arteries（mentorail）[J].Am J Cardiol，2000，86：385-389.

[29] Chen S，Duan B，Liu Z，et al.Cutting balloon argioplasty for treatment of coronary in-stent restenosis：immediate results and 6-month outcomes[J]. Chin Med J（Engl），2002，115（2）：166-169.

[30] Spanos V，Stankovic G，Tobis J，et al.The challenge of in-stent restenosis：insights from intravascular ultrasound[J].Eur Heart J，2003，24（2）：138-150.

基因治療的基本策略范文6

提要　尋找與高血壓以及血壓調(diào)節(jié)有關(guān)的基因，已成為當(dāng)前心血管領(lǐng)域的研究焦點(diǎn)之一，一些屬于單基因遺傳病的繼發(fā)性高血壓的致病基因已被識(shí)別。原發(fā)性高血壓是一種多基因遺傳病，其發(fā)病系遺傳與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，這為高血壓易感基因研究帶來很大困難。迄今大多用候選基因法進(jìn)行高血壓相關(guān)基因研究。在人和動(dòng)物模型的研究中，有關(guān)高血壓候選基因多態(tài)性的報(bào)道已有四十多種，但各家結(jié)果不一致。近年來用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行全基因組掃描和連鎖分析，它已成功地用于多基因病相關(guān)基因的定位克隆研究。應(yīng)用該技術(shù)對(duì)原發(fā)性高血壓易感基因的定位研究正在進(jìn)行中。

Gene studies in hypertension:State-of-art

Abstract 　 The search for genes influencing blood pressure or hypertension has become one of the focal point of cardiovascular research. A few disease genes causing secondly hypertension，as a result of a single gene defect， have been identified. However，essential hypertension is a polygenic disease and both genetic and environmental factors play important roles in its development. This fact makes the identification of its susceptibility genes more difficult. So far most studies to reveal the genes related to essential hypertension have employed a candidate gene approach.Using this strategy，the associations between polymorphisms of over forty genes with essential hypertension have been reported in human or in animal models.However，the results are not consistent .Recently，a genome－wide scan and linkage analysis using microsatellite markers becomes a useful approach in the positional cloning of genes in polygenic diseases.Its application for mapping susceptibility genes of hypertension is ongoing.

Key words　essential hypertension;gene;candidate gene approach;genome－wide scan

和平利用原子能、登月和人類基因組計(jì)劃（HGP）是本世紀(jì)最重要的三大科技成就。1990年啟動(dòng)的美國(guó)HGP的研究目標(biāo)是在2005年最終闡明人類基因組DNA的全序列、發(fā)現(xiàn)所有人類基因、完成它們?cè)谌旧w上的定位。目前人類基因組遺傳圖和物理圖已經(jīng)完成，大規(guī)模測(cè)序技術(shù)和生物信息學(xué)獲得迅速發(fā)展，提前達(dá)到HGP研究目標(biāo)已成定局。在“結(jié)構(gòu)基因組學(xué)”獲得巨大進(jìn)展的推動(dòng)下，一個(gè)以破譯基因功能信息為目標(biāo)的“功能基因組學(xué)”已應(yīng)運(yùn)而生。為應(yīng)對(duì)激烈的國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)和日新月異的科技進(jìn)步，我國(guó)科學(xué)家率先提出了“疾病基因組學(xué)”這一新概念，從而確立了我國(guó)人類基因組研究的重點(diǎn)和特色。在“863”計(jì)劃等相關(guān)項(xiàng)目的研究基礎(chǔ)上，集合了國(guó)內(nèi)一批一流研究單位，一項(xiàng)以創(chuàng)立“疾病基因組學(xué)”理論和技術(shù)體系為目標(biāo)和“國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃”研究項(xiàng)目，已于今年初正式啟動(dòng)，這標(biāo)志著我國(guó)疾病基因研究已經(jīng)跨入積極參與大規(guī)模國(guó)際競(jìng)爭(zhēng)的時(shí)代。

1　繼發(fā)性高血壓基因研究現(xiàn)狀與展望

在高血壓基因研究方面，迄今已有10多種屬于單基因遺傳病性質(zhì)的繼發(fā)性高血壓的致病基因已被定位或克隆。它們是：與腎上腺皮質(zhì)激素代謝有關(guān)的基因：如醛固酮合成酶基因與11β羥化酶基因形成嵌合基因，導(dǎo)致糖皮質(zhì)激素可抑制性醛固酮增多癥；與離子轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的基因：如已查明Liddle綜合征系上皮細(xì)胞鈉通道β.γ亞單位突變所致；一些因兒茶酚胺產(chǎn)生過量導(dǎo)致高血壓的常染色體顯性遺傳疾病，它們的致病基因已被識(shí)別。此外，某此類型的多囊腎致病基因也已被定位。需要指出單基因性質(zhì)的高血壓基因研究

并未結(jié)束，可能還有一些尚未認(rèn)識(shí)的新病種有待發(fā)掘，如在土耳其發(fā)現(xiàn)一種以嚴(yán)重高血壓伴短指畸形為特征的常染色體顯性遺傳病，新近其基因已被定位。此外，闡明致病基因在高血壓發(fā)病中的分子生物學(xué)和病理生理機(jī)制、探索基因治療等方面有待進(jìn)一步研究。

2　原發(fā)性高血壓基因研究現(xiàn)狀與展望

單基因病致病基因的識(shí)別，猶如池塘中的魚已釣一個(gè)少一個(gè)；而多基因病易感基因卻似深海中的魚，若隱若現(xiàn)、深不可測(cè)。當(dāng)前疾病基因的研究重點(diǎn)從單基因病轉(zhuǎn)向多基因病已成趨勢(shì)，但難度也越來越大。原發(fā)性高血壓（EHT）是一多基因遺傳病，其發(fā)病率高、危害性大、家系樣本收集相對(duì)比較容易，因此已成為當(dāng)前多基因病研究的重點(diǎn)和熱點(diǎn)之一。

EHT發(fā)病是遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，一般認(rèn)為，人群中血壓變異的30％～60％是由遺傳因素決定的。遺傳因素賦予個(gè)體對(duì)于EHT的易感程度，因此與EHT發(fā)病相關(guān)的基因稱為易感基因而不是致病基因。

自90年代起識(shí)別EHT相關(guān)基因的研究開展得十分活躍，目前最常用的方法為候選基因法，其基本策略和步驟為：以參與血壓調(diào)節(jié)機(jī)制的蛋白為對(duì)象，確定候選基因；進(jìn)行遺傳連鎖分析，確定該候選基因座位與高血壓是否連鎖；篩查該候選基因的各種突變體；基因多態(tài)性與高血壓間的關(guān)聯(lián)研究，以確定該基因突變體是否與EHT相關(guān)。相關(guān)基因識(shí)別后到最終確定為EHT易感基因還有很多工作要做。

在已研究過的所有EHT候選基因中，以血管緊張素原（AGT）基因的研究最為深入。多數(shù)報(bào)道指出AGT基因與EHT相連鎖，不少研究發(fā)現(xiàn)AGT基因的M235T變異體（即基因突變導(dǎo)致AGT第235號(hào)氨基酸由甲硫氨酸轉(zhuǎn)變?yōu)樘K氨酸）與高血壓相關(guān)聯(lián)，235T純合個(gè)體的血漿AGT水平顯著高于235M純合個(gè)體。但也有一些研究無法證實(shí)AGT基因M235T多態(tài)性與高血壓有關(guān)。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）基因存在插入型（Insertion，I）或缺失型（Deletion，D）多態(tài)性。目前一般認(rèn)為ACE基因這一多態(tài)性與高血壓關(guān)系不大，但似與心、腦、腎等靶器官損害有關(guān)。盡管薈萃分析結(jié)果支持這一觀點(diǎn)，但ACE基因的DD基因型是否為心腦血管病的危險(xiǎn)因子，需待前瞻性研究加以證實(shí)。一組意大利學(xué)者對(duì)α－adducin基因與高血壓關(guān)系進(jìn)行過系列研究，提出α－adducin基因突變是鹽敏感性高血壓的遺傳基礎(chǔ)之一，從而引起廣泛重視，但目前多數(shù)報(bào)道不能證實(shí)這一結(jié)果。目前已經(jīng)研究過的EHT候選基因不下四、五十個(gè)，不能一一介紹。但迄今為止用這一方法未能肯定哪個(gè)基因與EHT相關(guān)。盡管如此EHT候選基因?qū)ο笕栽跀U(kuò)大，對(duì)于已研究過的候選基因?qū)ふ倚碌淖儺愺w，并探索它們與EHT間的關(guān)系還將繼續(xù)。另一方面，候選基因多態(tài)性的民族和地區(qū)差異的研究，尤其對(duì)于基因多態(tài)性分型用于指導(dǎo)臨床的可能性探討正越來越受到重視。

近年來應(yīng)用微衛(wèi)星引物進(jìn)行基因組掃描的技術(shù)已經(jīng)成熟，多色熒光標(biāo)記的微衛(wèi)星DNA引物已經(jīng)商品化。用300多對(duì)覆蓋整個(gè)基因組的微衛(wèi)星引物，選擇大樣本的EHT家系或同胞對(duì)進(jìn)行連鎖分析，有可能將EHT相關(guān)基因位點(diǎn)定位到某一染色體區(qū)域內(nèi)，分辨率可達(dá)10cM。進(jìn)一步用區(qū)域內(nèi)DNA多態(tài)標(biāo)記進(jìn)行精細(xì)定位，如能將范圍縮小到1cM以內(nèi)，便可直接大規(guī)模DNA測(cè)序，分離并克隆出EHT相關(guān)基因。全基因組掃描的應(yīng)用，在個(gè)別多基因遺傳病基因定位中已有成功報(bào)道。目前國(guó)內(nèi)外一些實(shí)驗(yàn)室正采用此技術(shù)進(jìn)行EHT相關(guān)基因的染色體定位研究，但迄今尚未見正式報(bào)道。

患者對(duì)藥物的反應(yīng)、藥物副作用以及藥物在體內(nèi)的代謝，都存在明顯的個(gè)體差異，這種差異都有一定的遺傳背景。如能在基因水平上闡明有關(guān)機(jī)制，將有可能通過檢測(cè)某個(gè)或某一組基因的多態(tài)性，預(yù)測(cè)藥物療效、減輕甚至避免副作用。“藥物基因組學(xué)”的出現(xiàn)為實(shí)現(xiàn)高血壓個(gè)體化治療帶來了希望。