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免疫組化范文1
免疫細(xì)胞學(xué)是免疫學(xué)與細(xì)胞化學(xué)相結(jié)合的一個分支學(xué)科，它是在免疫學(xué)理論基礎(chǔ)上利用抗原與抗體的特異性反應(yīng)，在細(xì)胞或組織中定位抗原或抗體。免疫組化技術(shù)是用標(biāo)記物或顯色物標(biāo)記的抗體檢測細(xì)胞和組織內(nèi)的抗原，從而達(dá)到診斷和研究疾病的目的。隨著免疫組織化學(xué)技術(shù)在臨床病理研究與診斷中的廣泛應(yīng)用，因其反應(yīng)步驟多，影響因素復(fù)雜，質(zhì)量控制已被越來越多的病理技術(shù)專家重視。2008年全國病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用研討會上提出將質(zhì)控應(yīng)用到免疫組化技術(shù)上。本文對免疫組化技術(shù)的標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)控管理進(jìn)行了探索，現(xiàn)介紹如下。
1 標(biāo)本的固定
為了更好地保持細(xì)胞和組織原有的形態(tài)結(jié)構(gòu)，防止組織自溶，必須對標(biāo)本進(jìn)行固定。標(biāo)本固定的好壞是影響病理診斷的關(guān)鍵，同樣也影響免疫組化的結(jié)果，所以固定是質(zhì)控的首要也是關(guān)鍵步驟。影響標(biāo)本固定主要因素有以下幾點。①標(biāo)本離體后固定不及時：一般離體標(biāo)本要求15 min內(nèi)必須固定[1]，最好是在手術(shù)室由專業(yè)的護(hù)士將離體的標(biāo)本用清水沖洗干凈后立即放入質(zhì)量濃度40 g/L中性甲醛內(nèi)，固定液的用量為標(biāo)本體積的5～10倍。而目前本院手術(shù)室做不到這一點，這就要求病理技術(shù)員在接到標(biāo)本后要及時固定，不能延誤時間。但是在手術(shù)室和路上延誤的時間不能控制。因此，呼吁臨床醫(yī)生應(yīng)和病理科聯(lián)合起來，將標(biāo)本固定地點放在手術(shù)室，以使標(biāo)本及時固定，減少因固定不及時而出現(xiàn)的診斷困難。②標(biāo)本固定的時間：40 g/L中性甲醛滲透速度一般是2 mm/h，隨著時間延長速度會逐漸減慢，增加濃度反而會降低滲透速度。一般手術(shù)標(biāo)本用40 g/L中性甲醛固定的時間以12～24 h為佳，最長不要超過72 h；如穿刺標(biāo)本可用AFF液固定2～4 h。有研究顯示，用40 g/L中性甲醛固定1周后的標(biāo)本，其組織抗原幾乎不能被檢出[1]。但是，日常工作中常常會遇到有人催發(fā)病理報告的情況，他們希望病理科的報告最好像檢驗科那樣早晨送下午就能拿到。這種情況下只有縮短制片程序，包括固定時間，這種操作只會增加病理診斷的風(fēng)險，埋下誤診的隱患。③固定液的種類及濃度不恰當(dāng)：免疫組化檢測常用的固定液有40 g/L中性甲醛、40 g/L鈣甲醛、40 g/L多聚甲醛磷酸緩沖液等。穿刺標(biāo)本可用AFF液固定。固定液濃度過高、過低都會因組織固定差而導(dǎo)致組織抗原丟失或易出現(xiàn)非特異性背景染色，從而影響免疫組化結(jié)果。EDTA是用于骨組織脫鈣的螯合劑，因在脫鈣過程中對組織的破壞性小而得到廣泛使用，缺點是脫鈣時間太長。④標(biāo)本固定時處理不當(dāng)：如淋巴結(jié)組織往往因包膜沒切開，影響了固定液的滲透，而使組織固定差。大標(biāo)本因沒切開固定，而使標(biāo)本固定不勻等，都可影響免疫組化染色。我們接診了很多低級別醫(yī)院來會診標(biāo)本，都存在以上問題，因固定差而直接影響免疫組化結(jié)果及診斷。
2 切片與烤片
免疫組化檢測的切片厚以3～4 μm為宜，淋巴結(jié)組織可行2 μm厚切片，太厚影響染色結(jié)果和診斷。因免疫組化反應(yīng)步驟多，易出現(xiàn)脫片現(xiàn)象，需要將載玻片處理后方可使用。處理方法：先將載玻片用肥皂水洗凈后，放入清潔液中浸泡12～24 h，清水沖洗2 h，蒸餾水洗5遍，體積分?jǐn)?shù)0.95乙醇浸泡后，用干凈的綢布擦干，再掛膠。掛膠方法有很多種，如： APES、鉻礬明膠液、多聚賴氨酸等。切片裱片要完整，不能有氣泡，烤片時溫度不能過高，65 ℃烤30 min即可進(jìn)行染色。烤片時間過短易造成脫片，溫度過高或過長可破壞抗原。
3 減少或消除非特異性染色
組織中非抗原抗體反應(yīng)出現(xiàn)的陽性染色稱為非特異性背景染色。最常見的原因是蛋白吸附于高電荷的膠原和結(jié)締組織成分上。常見的消除方法有：①在滴加第一抗體前用體積分?jǐn)?shù)0.02～0.05山羊血清或牛血清封閉組織上帶電荷基團(tuán)，而除去與第一抗體的非特異性結(jié)合。此種方法一般用于不需抗原修復(fù)的抗體或內(nèi)源性生物素較高的組織效果佳。②體積分?jǐn)?shù)0.03～0.06過氧化氫法是目前最常用的方法之一，我們認(rèn)為體積分?jǐn)?shù)0.05過氧化氫處理10～15 min的效果較好。③洗滌過程中用高鹽緩沖液沖洗切片，也是消除非特異性染色的方法之一。方法是將磷酸緩沖液中加入10 g/L的氯化鈉（pH 7.4）。④稀釋抗體濃度，但必須通過陽性對照來掌握稀釋的最佳濃度。我們的實踐證明，應(yīng)用北京中杉試劑公司生產(chǎn)的PV9000二步法試劑盒，可有效地避免內(nèi)源性生物素造成的非特異性染色，且操作簡便。
4 抗原修復(fù)
免疫組化在病理學(xué)上的應(yīng)用常因甲醛固定等因素影響造成抗原失活。解決因固定包埋導(dǎo)致抗原失活的問題有3個途徑：①開發(fā)新型抗體以識別甲醛固定后的組織抗原或提高免疫組化試劑的靈敏度；②用改良固定液取代甲醛；③挽救因甲醛固定而失活的抗原，即抗原修復(fù)。而后者因方法簡單而增敏效果顯著，在病理技術(shù)中得到廣泛應(yīng)用。抗原修復(fù)是影響染色結(jié)果的最關(guān)鍵因素，目前最常用的是加熱煮沸法，少數(shù)用酶消化法。加熱抗原修復(fù)是1991年由SHI等最先報道，其機(jī)制是通過加熱打開了組織抗原因甲醛固定所引起的抗原表位的交聯(lián)。修復(fù)的方法有高壓法、微波法、水浴法等。英聯(lián)邦免疫細(xì)胞化學(xué)室間質(zhì)控組織（UK NEQASICC）進(jìn)行的有105家實驗室參與、歷時兩年的研究結(jié)果顯示，ER、PR染色偏弱是由于微波加熱時間不足與實驗中操作控制不當(dāng)所致，強(qiáng)烈推薦使用高壓抗原修復(fù)[2]。國內(nèi)也有專家研究表明，目前抗原修復(fù)最突出和最頑固的問題是修復(fù)不夠。各種修復(fù)方法染色強(qiáng)度比較，高壓法>水浴法>微波法。抗原修復(fù)液常用的有枸櫞酸緩沖液（pH 6.0）、EDTA緩沖液（pH 8.0～9.0）等。在2008年全國病理學(xué)技術(shù)進(jìn)展和應(yīng)用研討會上周小鴿教授做了以下實驗（圖1）：A類抗原在任何pH條件下，修復(fù)效果都很好；B類抗原在低和高pH時，修復(fù)效果好，但在中等pH時，修復(fù)效果很差；C類抗原隨著pH的增高，修復(fù)結(jié)果越來越好。如果實驗室只想用1種修復(fù)液，又能兼顧3類抗原，就可選擇圖中3條曲線最靠近的區(qū)域所對應(yīng)的pH值，此處所對應(yīng)的pH為8.0～9.0。因此，他認(rèn)為高pH修復(fù)液比低pH修復(fù)液更好。我們認(rèn)為高壓修復(fù)具有壓力穩(wěn)定、受熱均勻、陽性檢出率和陽性強(qiáng)度高、背景著色少等優(yōu)點，對核染色陽性的抗原用pH 9.0的EDTA修復(fù)液效果較好，胞漿胞膜染色陽性的用pH 8.0的EDTA抗原修復(fù)液修復(fù)的效果較好，但如果采用pH 9.0的EDTA在高壓修復(fù)時易脫片。高壓修復(fù)的方法是：先將高壓鍋內(nèi)的修復(fù)液煮沸，將切片放入高壓鍋內(nèi)，將壓力加熱至最大（105 kPa）1～2 min，加熱功率不要大于1 000 W。有研究表明，Ki67與P53在使用電磁爐加熱時，隨著功率的增強(qiáng)，陽性強(qiáng)度反而減弱。我們認(rèn)為只要功率在800 W左右，不管是電磁爐還是電爐加熱對免疫組化的結(jié)果影響都不大。
5 標(biāo)準(zhǔn)化實驗對照
免疫組化對照實驗的設(shè)立在免疫組化標(biāo)準(zhǔn)化中是極其必要的。隨著病人法律意識的不斷增強(qiáng)，醫(yī)患之間的矛盾越來越大，病理醫(yī)師的診斷風(fēng)險也越來越大。這就要求醫(yī)生對染色結(jié)果要有正確判斷，同時也對病理技術(shù)人員提出了設(shè)立陽性和陰性對照的要求，這不但是對病人負(fù)責(zé)，也是保護(hù)自己的一種方式。陰性對照是用確定不含有待測抗原的組織作為陰性對照組織，陽性對照是對照組織中含有已知的抗原[3]。我們認(rèn)為在日常工作中設(shè)置陽性對照最關(guān)鍵，通常是用闌尾來做陽性對照組織，因為闌尾中含有多種組織成分如上皮、淋巴組織、平滑肌、間質(zhì)、神經(jīng)、血管、間皮等。
圖1 3種抗原不同pH條件下修復(fù)效果（略）
總之，要做出好的免疫組化結(jié)果，除了要求病理技術(shù)人員掌握豐富的理論知識外，還要求有較強(qiáng)的責(zé)任心，嚴(yán)格按標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化操作，只有這樣才能更好地將免疫組化技術(shù)應(yīng)用于臨床，服務(wù)于病人。
【參考文獻(xiàn)】
[1]王小亞，崔全才. 免疫組織化學(xué)病理診斷[M]. 北京：北京科學(xué)技術(shù)出版社， 2007：47.
免疫組化范文2
【關(guān)鍵詞】Tween-20；免疫組化；非特異性染色
表面活性劑Tween-20為聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸酯和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸酯的混合物，親水性強(qiáng)，為一種非離子型去污劑，能增加乳劑的穩(wěn)定性。也可作 2006―2012年龍里縣流行性腮腺炎疫情資料分析 神經(jīng)阻滯聯(lián)合甲鈷胺注射液治療帶狀皰疹后神經(jīng)痛效果觀察 保定市2004～2011年急性弛緩性麻痹病例監(jiān)測系統(tǒng)運轉(zhuǎn)情況分析 早產(chǎn)兒經(jīng)下肢置入PICC20例的方法探討 129例2型糖尿病患者合并惡性消化道腫瘤臨床分析 絕經(jīng)后婦女取宮內(nèi)節(jié)育器92例臨床分析 高血壓性腦出血156例臨床分析 蒙古族老年人慢性房顫（AF）319例抗凝治療分析 淺談產(chǎn)后出血的原因及防治措施 80例老年口腔修復(fù)臨床分析 不育不孕癥夫婦生殖道分泌物衣原體和支原體檢測結(jié)果分析 頭靜脈修剪高位重建動靜脈內(nèi)瘺11例 老年獲得性肺炎的臨床特點及預(yù)后分析 2012年昆明市五華區(qū)居民死亡原因分析 探討鈔票對健康促進(jìn)的影響 呼吸內(nèi)科感染常見病原菌與相關(guān)因素 南寧市吳圩鎮(zhèn)健康人丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶參考值的制訂 老年惡性骨腫瘤54例誤診原因分析 帶狀皰疹病人的健康教育方式及效果評價 承┮┪锏腦鋈薌痢＞匝櫸⑾置庖咦榛討屑尤肓ween-20的PBS緩沖液沖洗切片，能夠使切片更清潔，非特異性染色減少。本文對分別經(jīng)過PBS-Tween-20緩沖液及PBS緩沖液沖洗的免疫組化切片進(jìn)行對照，并將應(yīng)用體會介紹如下。
1 材料與方法
1.1 材料
PBS磷酸鹽緩沖液（0.01mol/L，PH7.2-7.4）、Tween-20、500ml容量瓶、
吸水紙，均購自福建邁新試劑有限公司。
1.2 方法
取500ml已配制好的PBS磷酸鹽緩沖液置容量瓶中，加入250μl Tween-20，充分混勻，待用。現(xiàn)將經(jīng)抗原修復(fù)后的組織切片分成3組（A、B、C）放入蒸餾水中備用。
A組：常規(guī)PBS磷酸鹽緩沖液沖洗后，專用免疫組化油筆劃圈。
B組：PBS-Tween-20緩沖液沖洗后，專用免疫組化油筆劃圈。
C組：專用免疫組化油筆劃圈后，PBS-Tween-20緩沖液沖洗。
將3組處理過的切片進(jìn)行同樣的免疫組化后續(xù)操作。
2 結(jié)果
A組 在抗體孵育過程中，抗體用量偏多，無需用吸水紙擦拭，同時還有個別組織邊緣干燥，發(fā)生了邊緣效應(yīng)。
B組 在抗體孵育過程中，抗體用量偏少，但每次滴加抗體前均需用吸水紙擦拭，未發(fā)生組織邊緣干燥。
C 組 在抗體孵育過程中，抗體用量偏少，無需用吸水紙擦拭，未發(fā)生組織邊緣干燥。
3 討論
本實驗室免疫組化染色標(biāo)本例數(shù)多，量大，半個工作日出片，由于一抗、二抗的孵育時間以及顯色時間比較固定，這就要求在操作過程中盡量減少操作時間，并且盡可能地降低非特異性染色。A組雖然免疫組化油筆的使用節(jié)省了時間，但只能防止滴加的試劑不向四周流失，如果組織偏大就無法保證一次性將滴加的試劑完全覆蓋整個組織，只有增加抗體用量將組織全部覆蓋，抗體用量偏多，并且可能導(dǎo)致抗體覆蓋不均，增加邊緣效應(yīng)、非特異性染色等。B組PBS-Tween-20緩沖液沖洗后，玻片上含有Tween-20，用吸水紙擦拭后使用免疫組化油筆劃的圈不能與玻片充分結(jié)合，再次沖洗后劃痕被Tween-20溶解，不能保持完整性，需用吸水紙另外擦拭干水分，耽誤時間。相比之下C組劃圈后和玻片充分結(jié)合，再用PBS-Tween-20緩沖液沖洗，劃痕不被溶解，將其傾斜在吸水紙上，劃痕能保持完整性，不用吸水紙另外擦拭，節(jié)省不少時間。
Tween-20為聚氧乙烯去水山梨醇單月桂酸脂和一部分聚氧乙烯雙去水山梨醇單月桂酸脂的混合物。由于其分子中有較多的親水性基團(tuán)（聚氧乙烯基），故親水性強(qiáng)，具有乳化、擴(kuò)散、增溶、穩(wěn)定等性能，是一種常用的非離子性去垢劑和表面活性劑，對人體無害、無刺激性，常用為醫(yī)藥品的乳化劑、擴(kuò)散劑和穩(wěn)定劑。用其多次沖洗能夠均勻覆蓋整張切片，如同在切片上增加了一層液體膜，不會使組織和切片空白區(qū)形成明顯的分界線，在離組織邊緣
該方法在本實驗室已使用1年余，與不加Tween-20的PBS緩沖液做過多次對照實驗，發(fā)現(xiàn)Tween-20對免疫組化染色結(jié)果無影響，可以放心使用。且PBS-Tween-20緩沖液配制方法簡單，2000ml每包的PBS加入1ml的Tween-20，濃度不太高，價格也便宜，同時各種抗體的價格昂貴，這樣節(jié)省了抗體的用量，節(jié)約醫(yī)療成本，值得推廣。
參考文獻(xiàn)：
免疫組化范文3
關(guān)鍵詞：宮頸；宮頸癌；高級別上皮內(nèi)瘤變；免疫組化；P16；HPV感染
宮頸癌（Squamous carcinoma of the cervix；SCC）是婦科常見的一種惡性腫瘤，我國每年約有15萬宮頸癌新發(fā)病例，每年約有8萬人死于子宮頸癌，其死亡率居女性腫瘤的第二位，僅次于乳腺癌[8]。1995年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)（IARC）專題討論認(rèn)為：HPV感染是宮頸癌發(fā)生的必要條件[1]，90%以上的宮頸癌伴有高危型HPV感染[2]。P16作為檢測高危HPV感染的免疫組化指標(biāo)，通過P16免疫組化檢測可作為診斷宮頸癌癌前病變及SCC的有力證據(jù)，可提高宮頸高級別上皮內(nèi)瘤變（CIN）及宮頸SCC的早期診斷率[5]。
宮頸組織切片P16免疫組化結(jié)果與宮頸病變病理組織學(xué)診斷的關(guān)聯(lián)性，作者對146例宮頸組織切片P16免疫組化及HE切片進(jìn)行研究，觀察宮頸組織切片P16免疫組化的病理組織學(xué)特點，為豐富傳統(tǒng)病理組織學(xué)的內(nèi)容提供依據(jù)。
1 臨床資料
從2012年至今宮頸P16免疫組化206例，按入選條件：①HE切片完整，組織結(jié)構(gòu)清晰；②羅氏VentanaBenchMark XT全自動免疫組化染色儀標(biāo)準(zhǔn)化操作制片[9]，符合該標(biāo)準(zhǔn)的入選病例146例。③選用羅氏試劑盒作為生物標(biāo)記物的檢測。④P16陽性標(biāo)準(zhǔn)：P16陽性顯示上皮細(xì)胞核與胞漿著色，且呈彌漫連續(xù)性染色，而局灶性染色和無著色均視為陰性[3]。
2 結(jié)果
2.1患者的年齡分布 呈正態(tài)分布，見圖1。
2.2 P16陽性率的年齡分布 15～55歲各組的P16陽性率變化不大，在30%～40%，55歲以上組急劇上升至73%，見圖2。
2.3病理特點 本組146例宮頸組織做P16免疫組化，P16陽性36例，陽性率24.66%。
2.3.1上皮內(nèi)P16陽性分布特點 P16的陽性表達(dá)主要是核表達(dá)，胞漿也有表達(dá)，呈彌漫狀棕褐色[4]。染色強(qiáng)度往往是鱗狀上皮基底層>棘層>表層。CINⅡ-CINⅢ和宮頸癌（包括鱗癌、腺癌和腺鱗癌中）P16呈現(xiàn)中等或強(qiáng)陽性胞漿、胞核表達(dá)，與文獻(xiàn)報道相符[4，6]，宮頸鱗狀上皮挖空細(xì)胞大部分表達(dá)陰性。
2.3.2 P16陽性的組織學(xué)特點，見圖3。
圖3
3 討論
免疫組化的標(biāo)準(zhǔn)化操作 研究組為科室2013年10月引進(jìn)美國羅氏公司BenchMark XT免疫組化自動儀后進(jìn)行觀察病例，操作標(biāo)準(zhǔn)化程度提高，實驗結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定、可靠[8-9]，并做陽性對照片，免疫組化染色效果理想。
P16表達(dá)強(qiáng)度往往是鱗狀上皮基底層>棘層>表層，CINⅡ-CINⅢ和宮頸癌（包括鱗癌、腺癌和腺鱗癌中）P16呈現(xiàn)中等或強(qiáng)陽性胞漿、胞核表達(dá)，挖空細(xì)胞的核大部分表達(dá)陰性。提示P16表達(dá)在生物活性強(qiáng)的細(xì)胞更為明顯。傳統(tǒng)認(rèn)為挖空細(xì)胞與HPV病毒感染有關(guān)，本組資料并不顯示挖空細(xì)胞與P16陽性有多大的相關(guān)性。
本組觀察認(rèn)為，P16陽性率與CIN向鱗癌漸變的過程相關(guān)，當(dāng)CINⅢ及CINⅢ累及腺體時，P16的陽性率與鱗癌一樣，P16陽性率達(dá)100%。目前已經(jīng)明確宮頸癌與持續(xù)高危HPV感染有關(guān)，但HPV感染可以是一過性的并未能說明就有癌變。研究證明，P16過表達(dá)已說明HPV癌蛋白的細(xì)胞已經(jīng)開始了細(xì)胞轉(zhuǎn)化過程（癌變），因此P16的陽性高度表達(dá)可以用作為宮頸癌變的標(biāo)記物，P16陽性表達(dá)是觀察宮頸早期癌變的良好指標(biāo)[4]。P16在正常宮頸、慢性宮頸炎、CINⅠ級、CINⅡ-Ⅲ、宮頸癌（鱗癌和腺鱗癌）中的陽性表達(dá)率依次增 加[7]。
本組觀察還提示，宮頸增生主要有兩種增生。一種為炎癥性或?qū)m頸脫垂時發(fā)生的適應(yīng)性增生，表現(xiàn)為鱗狀上皮各層增生，表層可有成片狀挖空細(xì)胞發(fā)生，有的上皮腳伸長，但少有多狀增生，此種上皮極少有P16陽性表達(dá)。另一種為不典型增生及癌，一般認(rèn)為，高危型HPV感染可啟動異常增生，往往增生的上皮厚度不大，但多見狀增生，細(xì)胞有一定異型性。統(tǒng)計前者P16陽性率僅15.4%，而多狀增生P16陽性高達(dá)83.3%，相比P
參考文獻(xiàn)：
[1]Franceschi S.The IARC commitment to cancer prevent ion： theexample of papillom avirus and cervical cancer[J].Recent ResultsCancer Res，2005，166（2）：277-297.
[2]Mu？oz N.The causal link between HPV and invasive cervical cancer-a population-based case-control study in Colombia and Spain[J].Int J Cancer，1992，52（5）：743-749.
[3]Pe？ek M1， Kinkorová I， Ferko R， Urgeová A， Bouda J. Evaluation of p16 protein in the managementof cervical dysplasia[J].Ceska Gynekol，2013，78（2）：195-199.
[4]周莉，孔敏，李海霞，等.P16在宮頸癌組織中的表達(dá)及臨床意義[J].中國實驗診斷學(xué)， 2013，17（9）：1614.
[5]張敏鴿，劉明暉.高危HPV與宮頸癌發(fā)生的相關(guān)性. 實用癌癥雜志2012年11月第27卷 第6期The Practical Journal of Cancer，November 2012，Vol 27，No.6：670.
[6]趙，楊向紅，羅秀波，等.HPV感染、p16蛋白表達(dá)與宮頸病變關(guān)系的研究[J].中國醫(yī)藥指南，2011，9（16）.
[7]黃平，田晶晶，彭海燕.宮頸癌癌前HPV 檢測的臨床意義[J].中外醫(yī)學(xué)研究，2011，9（29）.
免疫組化范文4
［關(guān)鍵詞］ 鼻咽組織;免疫組織化學(xué);標(biāo)準(zhǔn)化;質(zhì)量控制
Quality Control of Immunohistochemical Stainig in Slice of Nasopharynx Tissues
Abstract： Objective To establish a standard empirical process of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues catering to the requirement for pathological diagnosis and research in the future.Methods Introducing the methods of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues as well as the link of quality control in detail. Results The results shown that method has three features: stable and reliable， strong specificity， and high sensitivity. Conclusion This method can improve the quality ofimmunohistochemical staining of nasopharynx tissue.
Key words:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol
鼻咽癌是我國華南地區(qū)常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生的病因、發(fā)病機(jī)制以及發(fā)生發(fā)展也是我們廣東醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室一直關(guān)注和研究的課題。由于鼻咽組織活檢時不易大量取材，且組織中淋巴細(xì)胞較多，組織質(zhì)地較脆，石蠟切片常出現(xiàn)組織碎裂、染色發(fā)白、模糊不清、細(xì)胞固縮等現(xiàn)象，另外淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞表面上的Fc受體及一些反應(yīng)性淋巴細(xì)胞干擾免疫組化的結(jié)果，導(dǎo)致制作滿意的鼻咽組織石蠟切片及其免疫組化染色較為困難，繼而影響病理診斷及后續(xù)的科研工作。為此，我們摸索自己實驗室的工作條件及各種抗體最佳的實驗條件來制定標(biāo)準(zhǔn)化實驗流程，穩(wěn)定鼻咽組織石蠟切片及其免疫組化染色的質(zhì)量，現(xiàn)報道如下。
1 材料與方法
1．1 材料 來自廣東醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院臨床送檢的鼻咽標(biāo)本。
1．2 主要儀器 輪轉(zhuǎn)切片機(jī)(德國，Leica)、家用高壓鍋(廣州)。
1．3 主要試劑 p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人單克隆抗體、多克隆抗體及免疫組化染色SP試劑盒、濃縮型DAB試劑盒、抗體稀釋液均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。
1．4 組織切片的制備 鼻咽組織離體時立即用生理鹽水輕輕洗去組織上的血液及黏液，隨后即用4%中性緩沖甲醛液固定，并及時送病理科作進(jìn)一步處理。4%中性緩沖甲醛液固定不宜超過18 h。脫水從低濃度乙醇到高濃度乙醇梯度脫水，級差以10%為宜，一般從60%乙醇開始30 min，70%乙醇30 min，80%乙醇25 min，95%乙醇25 min，無水乙醇Ⅰ20 min，無水乙醇Ⅱ20 min;二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min;58 ℃石蠟浸蠟，期間最好更換1次，浸蠟3 h后60 ℃石蠟包埋制成蠟塊。一次性刀片進(jìn)行切片，切片厚度為2 μm～3 μm，40 ℃以下水溫展片，65 ℃溫箱烤片1 h～4 h。
1．5 免疫組化染色方法 切片烤片后脫蠟至水，然后蒸餾水洗兩次，高壓鍋內(nèi)放約5 cm深的自來水，大火加熱至沸騰，再將檸檬酸鹽緩沖液(200 ml～400 ml pH 6.0)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高溫塑料切片架上放入盛有緩沖液的搪瓷杯中，蓋上鍋蓋，扣上壓力閥，繼續(xù)中火加熱至噴氣，從噴氣開始記時1 min后，壓力鍋離開火源，冷卻至室溫(稍冷后，可在自來水龍頭下流水加速冷卻)，取出切片，先用蒸餾水沖洗兩次之后用PBS(pH 7.2～7.4)沖洗，余下按免疫組化步驟選擇不同的抗體進(jìn)行染色。
2 結(jié)果
鼻咽切片組織無收縮、開裂，組織結(jié)構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)清晰，鼻咽癌癌細(xì)胞及各種炎癥細(xì)胞能清晰辨認(rèn)，HE染色鮮艷，細(xì)胞核呈鮮明的藍(lán)色，細(xì)胞質(zhì)被伊紅染成深淺不同的粉紅色、桃紅色，核仁呈紅色，對比度良好(見圖1)。免疫組化染色結(jié)果為病變組織結(jié)構(gòu)完整、無脫片現(xiàn)象，陽性與陰性對比明顯，陽性物質(zhì)定位準(zhǔn)確；背景干凈、清晰，無非特異性著色(圖2)，組織結(jié)構(gòu)與細(xì)胞輪廓完整、清晰，染色結(jié)果穩(wěn)定可靠、敏感性高、特異性強(qiáng)、細(xì)胞核呈藍(lán)色、適合顯微照相等。
圖1 鼻咽癌組織(HE 400)（略）
圖2 Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的強(qiáng)陽性表達(dá)(SP 400)（略）
3 討論
免疫組織化學(xué)由于其具有的復(fù)雜性，在技術(shù)應(yīng)用過程中存在不少問題，直接或間接地影響了最終的病理診斷，應(yīng)予以重視以下幾方面，才能從總體上保證鼻咽組織免疫組化染色的質(zhì)量。
3.1 制作優(yōu)質(zhì)石蠟切片是做好鼻咽組織免疫組化染色的基礎(chǔ) 取材時鼻咽組織上的血液及黏液將影響固定液的滲透和干擾免疫組化染色的結(jié)果，而且鼻咽組織由于組織中淋巴細(xì)胞比較豐富和致密，間質(zhì)成分較少是難以制作優(yōu)質(zhì)石蠟切片的主要原因，所以組織固定的好壞是影響免疫組化結(jié)果的關(guān)鍵因素。因此有條件時，鼻咽組織離體時立即用生理鹽水洗去組織上的血液和黏液，并用4%中性緩沖甲醛液固定；或者用4%中性緩沖甲醛液固定后及時送病理科做進(jìn)一步處理：即輕輕晃動瓶內(nèi)固定液，利用原有固定液洗去鼻咽組織上的血液及黏液，再換一次4%中性緩沖甲醛液固定。乙醇脫水盡可能從較低濃度起始，以免組織過度收縮。常溫下二甲苯透明時間≤30 min，不然組織變脆。制片嚴(yán)格按操作程序進(jìn)行，否則是免疫組化產(chǎn)生假陽性、假陰性或脫片的主要原因。
3.2 鼻咽組織蠟塊的管理 因為要考慮患者的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，經(jīng)病理確診后的病例做免疫組化染色不普遍，鼻咽組織做免疫組化染色絕大部分是教師或研究生的研究課題需要。為了檔案資料的齊全和避免醫(yī)療糾紛，＜2 mm組織的蠟塊一般不允許再切片。教師或研究生選擇做免疫組化的鼻咽組織蠟塊要通過觀察HE染色切片的組織形態(tài)的基礎(chǔ)上來決定，根據(jù)診斷來選擇，不要選擇組織壞死和出血多的蠟塊，所有需要做免疫組化的鼻咽組織切片均由有經(jīng)驗的專業(yè)技術(shù)員切片，以防組織蠟塊切削過多。切片完畢后組織蠟塊要及時封蠟歸檔，力求科研工作有延續(xù)性和檔案資料的完整性。
3.3 免疫組化切片的質(zhì)量控制要求 免疫組化染色使用的玻片必須用飽和的重鉻酸鉀濃硫酸液浸泡3 d以上，撈出后用自來水徹底清洗干凈，再經(jīng)95%乙醇過一遍，晾干后涂防脫片劑烘干備用。裱片時切片片膜不能留有氣泡，烤片時溫度過低、時間過短，則易脫片，溫度過高、時間過長則對抗原有破壞，烤片后用專用二甲苯、乙醇脫蠟至水洗，脫蠟要徹底。我們曾采用微波加熱等方法進(jìn)行抗原修復(fù)，但效果不如高溫高壓抗原修復(fù)法理想。另外高溫高壓加熱時間的長短很重要，從組織切片放入緩沖液到高壓鍋離開火源的總時間控制在3 min內(nèi)，時間過長，可能會使染色背景加深。檸檬酸緩沖液不能重復(fù)使用，且容量必須保證所有切片都能浸泡到，整個染色過程不要讓切片干涸。顯色在鏡下控制，時間約3 min～7 min，在陽性明確的部位著淡黃色即終止顯色，此時顯色程度較佳，能有效地避免背景著色。蘇木素復(fù)染后要充分返藍(lán)，否則背景呈紫紅色(見圖3)。
圖3 蘇木素復(fù)染未充分返藍(lán)、背景呈紫紅色（略）
3.4 增強(qiáng)特異性著色、降低非特異性染色是免疫組化的質(zhì)量保證 抗體是免疫組織化學(xué)最核心的試劑，其質(zhì)量直接影響免疫組織化學(xué)的結(jié)果判斷繼而影響診斷，由于鼻咽組織中的淋巴細(xì)胞、網(wǎng)狀細(xì)胞會產(chǎn)生非特異性染色。因此要選擇特異性強(qiáng)、效價高的一抗，新購進(jìn)的抗體儲存在4 ℃冰箱并進(jìn)行預(yù)實驗，摸索出最佳實驗條件。抗體的稀釋包括特異性一抗、中間聯(lián)結(jié)抗體及標(biāo)記抗體，其稀釋度與抗體的濃度、質(zhì)量及有效期、孵育時間和采用的方法等。防止失效的抗體進(jìn)入實驗室，此外要選擇病變典型的做免疫組化染色對照，一定要每一批免疫組化均設(shè)有已知陽性對照和用PBS代替一抗的空白對照。
3.5 免疫組織化學(xué)結(jié)果的判讀 結(jié)果的判斷免疫組化切片應(yīng)是陽性標(biāo)記強(qiáng)而非特異性染色淡或無，兩者形成鮮明的對比，陽性表達(dá)必須在細(xì)胞或組織特定的部位，細(xì)胞邊界清楚;每批染色都要有陽性對照、陰性對照和自身對照才能對染色結(jié)果作出正確判斷。判斷標(biāo)準(zhǔn)常根據(jù)陽性細(xì)胞的百分比或陽性細(xì)胞的染色深度來判斷，其顏色深淺反映抗原量的多少。免疫組化染色結(jié)果還要結(jié)合組織形態(tài)學(xué)判斷是真正的陽性染色而非其他著色。陽性反應(yīng)分布總是有規(guī)律、局限、定位準(zhǔn)確和一定形態(tài)特征的，如細(xì)胞膜著色呈圓形;典型的細(xì)胞核著色為均質(zhì)狀，核仁和染色質(zhì)呈顆粒狀著色。
3.6 免疫組織化學(xué)陽性庫的建立 為了保證陽性對照的可靠性，在日常工作中要收集各種抗原的陽性組織和陽性切片，逐步建立陽性對照切片庫及相應(yīng)的電子檔案庫。如預(yù)期結(jié)果為陰性或病理形態(tài)診斷與免疫組化結(jié)果相反時，必須要有陽性對照才能作出正確的病理診斷，陽性對照能說明染色技術(shù)和陰性結(jié)果的可靠性，不是由于標(biāo)本處理不當(dāng)導(dǎo)致的抗原喪失、方法錯誤、技術(shù)不熟練等造成的假陰性。鼻咽組織免疫組化染色步驟多、過程長、影響因素也多，因此只有在各個細(xì)節(jié)都認(rèn)真對待，然后以常規(guī)的形式相對固定下來，才能確保其免疫組織化學(xué)結(jié)果的可靠性。
參考文獻(xiàn)：
［1］ 陳杰，鄭杰，霍臨明.重視免疫組織化學(xué)的質(zhì)量控制和標(biāo)準(zhǔn)化［J］.中華病理學(xué)雜志，2005，(2)：6566.
免疫組化范文5
【關(guān)鍵詞】 MMP-2； MMP-9； 子宮內(nèi)膜腺癌； 免疫組化； 腫瘤； 轉(zhuǎn)移
在過去20年中，子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢。2010年美國估計新發(fā)子宮內(nèi)膜癌43 470例，同期宮頸癌只有12 200例[1]。雖然傳統(tǒng)的手術(shù)、放化療等多種治療措施的綜合應(yīng)用已顯著地提高了患者的生存質(zhì)量，但子宮內(nèi)膜腺癌的浸潤和轉(zhuǎn)移仍是許多患者死亡的主要原因。繼續(xù)認(rèn)識子宮內(nèi)膜腺癌腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為，探討其浸潤和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，開發(fā)新的抗腫瘤藥物，是目前亟待解決的問題。目前關(guān)于MMPs在子宮內(nèi)膜癌中的研究較多[2-6]，但研究結(jié)果不一致，目前仍存在爭議。本研究采用免疫組化方法檢測MMP-2、MMP-9在不同子宮內(nèi)膜組織中的表達(dá)，研究子宮內(nèi)膜腺癌的相關(guān)生物學(xué)行為，探討兩者與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生、發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移的相關(guān)性，為子宮內(nèi)膜腺癌的早期臨床診斷和預(yù)后判斷、靶向治療提供理論依據(jù)。
1 資料與方法
1.1 一般資料 收集蓬萊市人民醫(yī)院2010年1月-2013年12月手術(shù)切除、經(jīng)病理確診的100例子宮內(nèi)膜腺癌組織蠟塊和30例子宮內(nèi)膜增生組織蠟塊，同期因無癥狀子宮肌瘤行子宮全切除術(shù)的20例正常子宮內(nèi)膜作為對照組。子宮內(nèi)膜腺癌患者年齡37～68歲，平均（50.67±7.93）歲，所有患者在手術(shù)前均未放化療或內(nèi)分泌治療，不合并其他部位的惡性腫瘤，病例資料查詢提示每組患者的孕產(chǎn)史差異無統(tǒng)計學(xué)意義。所有切片染色后均經(jīng)病理證實，子宮內(nèi)膜腺癌病例采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟（FIGO 2009年）標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行手術(shù)病理分期以及組織學(xué)分級，其中手術(shù)-病理分期組中Ⅰ期58例、Ⅱ期22例，因Ⅲ、Ⅳ期均為晚期，合并兩期病例共為20例；組織學(xué)分級：G1 65例、G2 24例、G3 11例。肌層浸潤
1.2 檢測方法及原理 所有標(biāo)本均經(jīng)固定、包埋、切片，采用免疫組織化學(xué)SP（鏈霉素抗生物蛋白-過氧化酶）方法檢測。步驟按試劑盒說明書嚴(yán)格操作。第一抗體：MMP-2、MMP-9鼠抗人單克隆抗體（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）、第二抗體：即用型免疫組化S-P試劑盒、DAB顯色試劑盒（北京中杉）。實驗原理：應(yīng)用免疫學(xué)基本原理-抗原抗體反應(yīng)，通過化學(xué)反應(yīng)使標(biāo)記抗體的顯色劑（熒光素、酶、金屬離子、同位素）顯色來確定組織細(xì)胞內(nèi)抗原（多膚和蛋白質(zhì)），對其進(jìn)行定位、定性及定量的研究。MMP-9另需要做抗原熱修復(fù)。
1.3 MMP-2、MMP-9陽性的評價標(biāo)準(zhǔn) 以細(xì)胞膜和/或細(xì)胞漿出現(xiàn)明顯的黃色或棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞，其染色深度的評分標(biāo)準(zhǔn)參照Shimizu等[7]的方法，根據(jù)每張病理切片的細(xì)胞內(nèi)著色的強(qiáng)度，如無著色、淡黃色、棕黃色、棕褐色分別評分為0、1、2、3分；將著色陽性細(xì)胞的面積按無著色、著色2/3分別評分為0、1、2、3分。再計數(shù)子宮內(nèi)膜腺癌腫瘤細(xì)胞的總數(shù)和陽性表達(dá)的細(xì)胞數(shù)，最后表達(dá)強(qiáng)度的結(jié)果就由染色細(xì)胞數(shù)和染色深度的共同評分來評價，兩者評分相加作為該切片的最終評分，以評價細(xì)胞中兩者的表達(dá)強(qiáng)度。評分由低到高分為4級，0～1分為（-），2～3分為（+），4～5分為（++），6分為（+++）。其中0～1分為陰性，2～3分為弱陽性，4～5分為陽性，6分為強(qiáng)陽性。
1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 所有數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，表達(dá)陽性率的比較采用字2檢驗（chi-square）和Fisher精確概率檢驗法，表達(dá)強(qiáng)度的比較采用多組有序分類資料的Kruskal Wallis H秩和檢驗，以P
2 結(jié)果
2.1 不同子宮內(nèi)膜組織中MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)比較 MMP-2蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜腺癌的陽性表達(dá)率分別為15.0%（3/20）、26.7%（8/30）、88.0%（88/100），MMP-9蛋白在正常子宮內(nèi)膜組織、子宮內(nèi)膜增生癥、子宮內(nèi)膜腺癌的陽性表達(dá)率分別為25.0%（5/20）、33.3%（10/30）、95.0%（95/100），差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P0.05），見表1～2。
2.2 MMP-2、MMP-9在子宮內(nèi)膜腺癌組織中的表達(dá)情況 手術(shù)分期Ⅰ期、Ⅱ期組分別與Ⅲ、Ⅳ期組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P
3 討論
3.1 MMPs的生物學(xué)作用 國外多項研究表明，MMPs是降解細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）中最重要的酶類，MMPs超家族最早參與腫瘤的浸潤與轉(zhuǎn)移，在多種腫瘤組織的浸潤和轉(zhuǎn)移中起了重要的作用。MMPs在正常組織細(xì)胞中沒有或僅有弱表達(dá)，而在惡性腫瘤組織中的陽性表達(dá)率明顯高于正常組織或良性腫瘤組織[8]。MMPs主要由結(jié)締組織細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、粒細(xì)胞及膠原細(xì)胞等合成和分泌，能消化細(xì)胞外基質(zhì)和基底膜的蛋白酶類，在多種病理、生理過程及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮作用[9]。MMP-2、MMP-9是MMPs超家族的重要成員，通過消化細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）和基底膜（BM）而破壞組織細(xì)胞的結(jié)構(gòu)，以參與腫瘤細(xì)胞的惡。多項研究表明，腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的潛能與腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生MMP-9的能力有著密切的正相關(guān)關(guān)系，他們不僅參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，而且還對腫瘤細(xì)胞的黏附和能動性有影響[10-11]。MMP-2具有潛在活化細(xì)胞外基質(zhì)結(jié)構(gòu)蛋白的能力，在吸引炎癥細(xì)胞和刺激腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中起重要的作用[12]。
3.2 MMP-2、MMP-9與子宮內(nèi)膜腺癌的相關(guān)性 子宮內(nèi)膜不典型增生是子宮內(nèi)膜腺癌的癌前病變，本研究結(jié)果表明MMP-2、MMP-9在子宮內(nèi)膜增生癥各級組織中的陽性表達(dá)率均明顯高于正常子宮內(nèi)膜組織，隨著子宮內(nèi)膜增生程度加重，其表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)，發(fā)展至子宮內(nèi)膜腺癌，其表達(dá)強(qiáng)度最高，差異顯著，與Di等[3]研究結(jié)論一致，認(rèn)為子宮內(nèi)膜癌組織中MMP-2和MMP-9的陽性表達(dá)率比正常子宮內(nèi)膜組織及子宮內(nèi)膜增生癥明顯增強(qiáng)。表明MMP-2和MMP-9與從子宮內(nèi)膜癌前病變發(fā)展至子宮內(nèi)膜腺癌這一過程相關(guān)，兩者強(qiáng)陽性表達(dá)預(yù)測子宮內(nèi)膜組織癌變的可能性大，可作為早期診斷子宮內(nèi)膜腺癌的有效分子生物學(xué)指標(biāo)。
3.3 MMP-2和MMP-9與子宮內(nèi)膜腺癌進(jìn)展的關(guān)系 子宮內(nèi)膜腺癌的轉(zhuǎn)移方式主要為直接轉(zhuǎn)移和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，促進(jìn)其轉(zhuǎn)移的因素目前尚待研究。本研究結(jié)果提示：MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)率越高，子宮內(nèi)膜腺癌的手術(shù)-病理分期越晚，組織分化越差。有肌層浸潤的子宮內(nèi)膜腺癌組織中MMP-2、MMP-9陽性表達(dá)高于無肌層浸潤組，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的子宮內(nèi)膜腺癌組織中MMP-2、MMP-9的陽性表達(dá)高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組。表明MMP-2、MMP-9不僅與子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)展密切相關(guān)，還參與子宮內(nèi)膜腺癌的轉(zhuǎn)移和侵襲。在參與子宮內(nèi)膜腺癌細(xì)胞的侵襲能力活動中發(fā)揮作用。表明MMP-2、MMP-9的高表達(dá)與子宮內(nèi)膜腺癌的惡性程度有關(guān)，且兩者的高表達(dá)提示與子宮內(nèi)膜腺癌的浸潤、轉(zhuǎn)移有關(guān)。因此，檢測MMP-2、MMP-9在子宮內(nèi)膜增生癥組織中的表達(dá)程度可預(yù)示惡變的可能，檢測兩者在子宮內(nèi)膜腺癌中的表達(dá)可作為預(yù)測子宮內(nèi)膜腺癌預(yù)后的指標(biāo)。
在子宮內(nèi)膜腺癌的發(fā)生及發(fā)展過程中，MMP-2、MMP-9表達(dá)增強(qiáng)是一個重要的分子事件。對MMP-2、MMP-9作用機(jī)制的全面認(rèn)識，將會為子宮內(nèi)膜腺癌的早期診斷和預(yù)后提供新的理論根據(jù)，為腫瘤的臨床治療開辟新的思路。但MMP-2、MMP-9參與子宮內(nèi)膜腺癌的具體過程和機(jī)制仍需要進(jìn)一步的腫瘤分子生物學(xué)研究及臨床試驗證實。
參考文獻(xiàn)
[1] Jemal A，Siegel R，Xu J，et al.Cancer statistics，2010[J].CA：Cancer J Clin，2010，60（5）：277-300.
[2] Aglund K，Rauvala M，Puistola U，et al.Gelatinases A and B （MMP-2 and MMP-9） in endometrial cancer-MMP-9 correlates to the grade and the stage[J].Gynecologic Oncology，2004，94（3）：699-704.
[3] Di Nezza L A，Misajon A，Zhang J，et al.Presence of active gelatinases in endometrial carcinoma and correlation of matrix metalloproteinase expression with increasing tumor grade and invasion[J].Cancer，2002，94（5）：1466-1475.
[4] Honkavuori M，Talvensaari-Mattila A，Soini Y，et al.MMP-2 expression associates with CA 125 and clinical course in endometrial carcinoma[J].Gynecol Oncol，2007，104（1）：217-221.
[5]Guo W，Chen G，Zhu C，et al.Expression of matrix metalloproteinase-2，9 and it's tissue inhibitor-1，2 in endometrial carcinoma[J].Zhonghua fu chan ke za zhi，2002，37（10）：604.
[6] Amalinei C，Cianga C，Balan R，et al.Immunohistochemical analysis of steroid receptors，proliferation markers，apoptosis related molecules，and gelatinases in non-neoplastic and neoplastic endometrium[J].Ann Anat，2011，193（1）：43-55.
[7] Shimizu M，Saitoh Y，Itoh H.Immunohistochemical staining of Ha-ras oncogene product in normal，benign，and malignant human pancreatic tissues[J].Hum Pathol，1990，21（6）：607-612.
[8] Strongin A Y，Collier I，Bannikov G，et al.Mechanism of cell surface activation of 72-kDa type Ⅳ collagenase isolation of the activated form of the membrane metalloprotease[J].J Biol chem，1995，270（10）：5331-5338.
[9] Vihinen P，K?h?ri V M.Matrix metalloproteinases in cancer：prognostic markers and therapeutic targets[J].Int J Cancer，2002，99（2）：157-166.
[10] Lin L F，Chuang C H，Li C F，et al.ZBRK1 acts as a metastatic suppressor by directly regulating MMP9 in cervical cancer[J].Cancer Res，2010，70（1）：192-201.
[11] Loesch M，Zhi H Y，Hou S W，et al.p38γ MAPK cooperates with c-Jun in trans-activating matrix metalloproteinase 9[J].J Biol Chem，2010，285（20）：15149-15158.
免疫組化范文6
1 資料與方法
1.1 一般資料 收集2014年6月～2015年2月我院病理科22例乳腺腫瘤術(shù)中的冰凍切片，其中浸潤性導(dǎo)管癌7例、導(dǎo)管原位癌3例、導(dǎo)管狀瘤3例、狀癌2例及其他良性乳腺腫瘤7例。納入標(biāo)準(zhǔn)為：①閱冰凍HE片后，是否浸潤難以確定；②良惡性難以區(qū)分。
1.2主要試劑 即用型EnVision super非生物素免疫組化檢測試劑盒，鼠抗人CK5/6 單克隆抗體，陽性對照選用邁新公司提供的陽性對照片，陰性對照選用鼠IgG同比稀釋液。
1.3方法
1.3.1常規(guī)免疫組化檢測技術(shù) ①石蠟切片65℃烘箱2h后，常規(guī)脫蠟水洗；②高溫高壓修復(fù)，PBS 清洗3min×3次；③除去PBS液，置放在4℃冰箱，滴加一抗后PBS清洗3min×3次，滴加二抗后存放在室溫下孵育30min；④除去PBS液，DAB顯色，高倍鏡下觀察；⑤自來水沖洗后進(jìn)行蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明及中性樹膠封固。
1.3.2快速免疫組化檢測技術(shù) ①冰凍切片甲醇固定20s后迅速入PBS清洗3次；②滴加一抗37℃孵育10min后再予PBS清洗20s 3次；③二抗37℃孵5min后予PBS清洗20s 3次；④DAB顯色，蘇木素復(fù)染10s，常規(guī)脫水封片。
1.4 判斷結(jié)果 將陽性細(xì)胞按其數(shù)量及染色強(qiáng)度分為3級，按陽性細(xì)胞所占比例及分布情況記錄如下：陽性細(xì)胞數(shù)50%記為強(qiáng)陽性（+++）。
1.5統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 18.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，計數(shù)資料采用χ2檢驗，以P
2 結(jié)果
22例乳腺腫瘤患者的術(shù)中冰凍切片行快速EnVision免疫組化法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)無明顯的信號染色干擾背景，兩種免疫組化檢測技術(shù)診斷結(jié)果符合率高但清晰度及步驟優(yōu)于組織切片常規(guī)免疫組化染色，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見表1。
3 討論
大部分乳腺腫瘤的腺泡周圍有功能性血管纖維結(jié)締組織，乳腺整個腺管系統(tǒng)均被覆有腺上皮和肌細(xì)胞兩層細(xì)胞。腺泡在病變情況下，細(xì)胞形態(tài)及成分比例的變化，不同病變其免疫組化表型也各有不同，特別是判斷肌上皮的存在與否對乳腺疾病的病理診斷和鑒別診斷是非常重要的[3]。但在HE切片上，是很難對此做出判斷的。在乳腺腺管的中間腺細(xì)胞、定向干細(xì)胞和中間肌細(xì)胞中表達(dá)CK5/6，其中85%～98%普通導(dǎo)管增生CK5/6強(qiáng)陽性，而導(dǎo)管原位癌和不典型導(dǎo)管增生中的表達(dá)明顯減少，可作為導(dǎo)管原位癌和小葉原位癌，普通導(dǎo)管/小葉增生鑒別的有用標(biāo)記物[4，5]。快速免疫組化法與常規(guī)法相比，步驟相應(yīng)縮短。此外，因抗原非常新鮮，與一抗二抗結(jié)合的時間縮短，也不易發(fā)生抗原丟失的現(xiàn)象，對實驗結(jié)果不會產(chǎn)生影響。本研究發(fā)現(xiàn)，快速EnVision免疫組化法檢測CK5/6在乳腺腫瘤中的表達(dá)結(jié)果與常規(guī)免疫組化相比，病理診斷結(jié)果相符率較高。22例乳腺腫瘤患者的冰凍切片中，除1例導(dǎo)管原位癌的CK5/6的表達(dá)EnVision快速法為陰性但常規(guī)法為陽性外，其余診斷結(jié)果均基本相符。筆者分析可能是由于連續(xù)切片后，只選一片組織做檢查出現(xiàn)無所測抗原或者是個別組織對抗體的表達(dá)差異而造成的。
病理診斷醫(yī)師在巨檢的時候，憑經(jīng)驗認(rèn)為僅憑閱冰凍HE片可能難以區(qū)別良惡性，往往需要借助免疫組化結(jié)果來診斷，常規(guī)冰凍切片可以和快速免疫組化同步進(jìn)行，不影響冰凍診斷的出報告時間。在閱冰凍HE片后，需要借助免疫組化結(jié)果來診斷的可以進(jìn)行快速免疫組化法，能起到明確診斷的關(guān)鍵作用。
綜上所述，筆者認(rèn)為應(yīng)用快速EnVision免疫組化法檢測乳腺術(shù)中冰凍標(biāo)本中CK5/6的表達(dá)情況，速度快且準(zhǔn)確率高，對病理醫(yī)生診斷所測乳腺標(biāo)本的病理學(xué)類型發(fā)揮重要作用，并為臨床醫(yī)生決定手術(shù)方法和范圍提供有效幫助。
參考文獻(xiàn)：
[1] 吳秉銓， 劉彥仿. 免疫組織化學(xué)病理診斷[M]. 北京科學(xué)技術(shù)出版社， 2007： 9.
[2] 何沁， 徐華. 乳腺腫瘤冷凍切片診斷中快速EnVision 技術(shù)的價值[J]. 臨床與實驗病理學(xué)雜志， 2014， 23 （5）： 553-556.
[3] Moriya T， Kozuka Y. The role of immunohistochemistry in the differential diagnosis of breast lesions[J]. Pathology， 2009， 41（1）： 68-76.
