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本文作者：蘭海云 汪愛勤 尹文 單位：第四軍醫大學基礎醫學部 第四軍醫大學基礎醫學部 第四軍醫大學中心實驗室

在體成像技術的發展及成像策略的不斷提高，能夠在活的生物體內揭示細胞和分子水平的諸多細微變化，有助于在生物整體、真實的體內環境中高時間分辨率地研究生命過程。針對某一生物過程的帶有光學標記的報告基因已被廣泛應用于細胞生物學的研究，近年來正被更多地用于在活的動物模型中探究人體內生理機能和疾病的生物學過程。利用熒光蛋白、螢光素酶基因等生物材料標記細胞、病原體和基因，早已被證實是一種在體內設置“檢測器”、體外直觀檢測的非常可行的策略[1]。

1在體生物發光成像技術的原理

通過生物技術將構建的以螢光素酶基因作為標記基因的載體（重組原核表達質粒、重組真核表達質粒或重組病毒），經轉化、轉染或感染并篩選得到重組病原菌、細胞（如免疫細胞、腫瘤細胞、胚胎干細胞等）或重組病毒（如腺病毒、慢病毒、逆轉錄病毒等）用于轉入小動物；或是將含螢光素酶及調控序列的載體線性化后經顯微注射等技術穩定整合于小動物基因組制備轉基因動物[2－4]。標記基因的表達可通過多種調控元件進行調控，如靶基因的啟動子和增強子等；標記的方法因研究領域、研究目的和實驗策略的不同而各異[4]，但最終都是在體內組織如血液、肝臟、腦、脾、腎等靶部位因特定生物過程的發生而伴隨產生有酶活性的螢光素酶。在注入底物即螢光素的條件下，螢光素酶催化底物反應產生特定波長的光信號，通過成像系統可以直觀檢測到光信號的產生及變化，實時反映體內發生的生物過程，如基因的調控表達、信號傳導、蛋白質之間的相互作用、細胞增殖與分化等。因此，在體生物發光成像技術可廣泛應用于分子生物學、細胞生物學、病毒學與免疫學、腫瘤學等研究領域[5－8]。

2在體生物發光成像技術的應用

2．1標記于腫瘤細胞、免疫細胞、胚胎干細胞等，轉入體內后進行成像

螢光素酶基因作為一種報告基因，最初應用于體外培養細胞內目的基因的表達研究。在體生物發光成像技術的發展，使其能夠應用于在體組織細胞的表達研究[9]。螢光素酶是一類生物發光酶，1種細胞可同時被2種具有不同底物的螢光素酶標記。例如其一可由一組成性穩定表達的啟動子驅動，作為內參，反應細胞數量的變化；另一螢光素酶由要研究的組織特異性啟動子驅動，其發光信號的變化，在消除細胞數量變化的影響后就可反映特定的啟動子在動物體內的表達活性[10－11]。

2．1．1腫瘤及抗腫瘤研究在體生物發光成像技術可直接實時地監測各種癌癥模型中腫瘤的生長和轉移，并可對癌癥治療中癌細胞的變化進行實時觀測和評估，能夠無創傷地定量檢測小鼠整體的原位瘤、轉移瘤及自發瘤。Klerk等[12]研究證實了利用此技術測量腫瘤負荷具有很高的可靠性。Minn等[13]應用該技術進行了乳腺癌肺轉移相關基因的研究，他們構建能夠表達熒光蛋白、螢光素酶的反轉錄病毒載體，并穩定轉染已獲得的不同亞群腫瘤細胞，先通過熒光激活細胞分選術篩選同一亞群內具有相同轉染效果（穩定表達外源蛋白即熒光蛋白和螢光素酶，且水平一致）的細胞，并尾靜脈注射免疫缺陷小鼠，通過檢測生物發光的部位和大小，評價不同亞群腫瘤細胞向肺部位的轉移情況及其轉移能力，再通過檢測細胞內各基因的表達差異來分析肺轉移相關基因。Gupta等[15－16]又用相似的方法來研究乳腺癌腦轉移相關基因及乳腺癌肺轉移過程中分化基因介導的腫瘤再起始，結果再次顯示了生物發光成像技術應用于腫瘤及癌轉移機理研究領域的優越性。

2．1．2抗腫瘤免疫及腫瘤細胞疫苗的研究用帶有生物發光標記基因的小鼠淋巴細胞或基因修飾的腫瘤細胞疫苗，可以檢測放射及化學藥物治療的效果，并可尋找在腫瘤骨髓轉移及抗腫瘤免疫治療中復雜的細胞機制。Cayeux等[17]用螢光素酶基因標記基因修飾的腫瘤細胞疫苗來免疫小鼠，而用另一種底物不同于前者的5，6－carboxy－succinimidyl－fluorescein標記該小鼠內一種與腫瘤相關的免疫細胞，通過2種不同的標記研究了基因修飾的腫瘤細胞疫苗免疫小鼠后抗原遞呈、免疫細胞之間的相互作用及不同免疫細胞在體內免疫過程中的作用。

2．1．3藥物促腫瘤細胞凋亡的研究當螢光素酶與抑制多肽以融合蛋白形式在哺乳動物細胞中表達，產生的融合蛋白無螢光素酶活性，細胞不能發光，而當細胞發生凋亡時，活化的caspase－3在特異識別位點切去抑制多肽，螢光素酶活性得到恢復，由此可用于觀察活體動物體內的細胞凋亡相關事件。細胞凋亡時被激活的caspase－3／7與DEVD－氨基螢光素（aminoluciferin）特異結合而被酶解為氨基螢光素，它可被螢光素酶識別而產生生物發光信號。Liu、Hickson等[18－19]利用這一現象設計的細胞凋亡檢測方法均能夠以極低的DEVD－氨基螢光素量獲得較強的發光強度，因而這一方法可用于評價TNFα（α腫瘤壞死因子）、FasL、TRAIL（TNF相關促凋亡配體）等因素針對腫瘤的治療效果。

2．1．4胚胎干細胞及再生醫學的研究胚胎干細胞在再生醫學領域極具應用前景，然而注入活機體的胚胎干細胞及其分化細胞尚存在顯著的細胞死亡、畸胎瘤的形成、宿主免疫排斥反應等障礙。應用在體生物發光成像技術，可對胚胎干細胞本身及其在注入機體后的存活、增殖、分化等生物事件的發生機理進行深入研究，從而使上述諸多問題得以解決[20]。

2．2標記病原微生物，用于研究感染致病機制、轉移途徑及宿主免疫反應等

在感染性疾病的研究中，在體生物發光成像技術的應用，不僅可以提供疾病進程中觀測病原體在動物體內的寄居部位、數量變化及對外界因素的反應等實時變化信息，而且更有助于揭示感染體內病原體逃逸宿主防御的機制[21]。對病原體感染過程非侵入性的檢測能夠對疾病進程實時地提供新的信息，且有可能發現新的感染位點[22]。Lucker等[23－26］以螢光素酶基因標記HSV－1（單純皰疹病毒）并分別侵染Ⅰ類干擾素受體缺失、Ⅱ類干擾素受體缺失、Ⅰ和Ⅱ類干擾素受體均缺失的小鼠，可觀察到HSV－1對不同干擾素受體缺失小鼠的肝臟、肺、脾、淋巴結的侵襲，及病毒從血液系統進入神經系統的過程，從而證實了不同干擾素在HSV－1感染中所起的不同的作用。Lucker等[27]針對痘苗病毒的類似研究也證實，不同干擾素在機體感染過程中各自和協同發揮的重要作用。#p#分頁標題#e#

2．3標記于基因治療載體用于探究基因治療機制和評價治療效果

將一個或多個目的基因安全有效地轉入體內靶細胞可用于基因治療，應用螢光素酶基因作為報告基因構建載體，觀察目的基因是否能夠在試驗動物體內持續高效和特異性表達。這種非侵入方式具有容易準備、低毒性及輕微免疫反應的優點。螢光素酶基因也可以插入脂質體包裹的DNA分子中，用來觀察脂質體為載體的DNA運輸和基因治療情況。Smith等[28]已經運用該技術進行了HSV作為肝臟疾病基因治療載體的可行性研究。Chou等[29]將帶有螢光素酶基因標記的穩定表達肝細胞癌抗原的質粒轉入沙門菌減毒株，并作為疫苗口服免疫模型小鼠，在體成像顯示了體內沙門菌成功表達抗原和沙門菌作為活菌疫苗在體內的清除過程。

2．4蛋白質間相互作用、信號轉導等的研究

蛋白片段互補策略廣泛用于研究細胞內蛋白質間的相互作用，這種策略在借助在體生物發光成像技術后就可以被運用到活體動物內，以非侵入、可量化、實時地顯示蛋白質之間的相互作用[31]。在動物體內直接觀察細胞中或活體動物體內2種蛋白質的相互作用，可將Firefly螢光素酶（Fluc）的N端與C端分離開，分別與2個可能產生相互作用的目的蛋白相連，并使2組蛋白由不同的載體分別誘導表達。在體的細胞內若2個目的蛋白能靠近并結合形成完整的Fluc，則會產生發光信號。Andrea等[32]建立了一種轉基因報告小鼠，由特異啟動子（TgG4F（＋／－））及其轉錄反式作用因子多聯體蛋白Gal4進行調控。將融合了Gal4BD的p53和融合了VP16的TAg的病毒載體共轉入該小鼠的肝臟細胞，在小鼠肝臟部位觀察到了明顯的發光信號，顯示p53與TAg的結合引發Gal4BD與VP16結合，結合的多聯蛋白順利與啟動子TgG4F（＋／－）結合，進而引發Fluc在肝臟組織的表達。

2．5體內干擾RNA及DNA疫苗的研究

目前RNA干擾技術已經發展成為一種體外轉錄后沉默基因的方法，在體內RNA干擾的轉錄后表達沉默可以引起各種廣泛的生物學效應，因此生物發光在體成像技術有力地促進了體內RNA干擾的研究和在體內利用RNA干擾技術進行其他疾病機理及生物治療的探索。McCaffrey[33]等通過將表達螢光素酶的真核表達載體與針對螢光素酶基因設計的雙鏈小干擾RNA（siRNA）共注射成年小鼠，與對照組比較，前者的熒光強度明顯減弱，表明針對性的雙鏈siRNA明顯起到抑制基因表達的作用。他們還構建表達功能性小發夾RNA（shRNA）的真核表達載體，與表達螢光素酶的載體共注射成體小鼠，與對照組相比，同樣觀察到長時程后熒光強度明顯減弱。RNA干擾技術成功用于臨床治療須保證雙鏈siRNA有效轉入體內并維持有效的濃度，而借助在體生物發光成像技術則可便捷準確地評價雙鏈siRNA運送方法的效果。Takeshita等[34－36]已利用該技術分別對各自所設計的不同的雙鏈siRNA運送方法進行了全面的評價，并發現合理的運送方法，如雙鏈siRNA與某些小分子化合物的連接修飾與單獨的注射雙鏈siRNA相比，前者能使雙鏈siRNA在體內較長時間內不被降解。RNA干擾可作為傳統DNA疫苗的補充，被用以在體內消除免疫抑制因子表達。DNA疫苗的效應常常因相關的信號轉導途徑下調該獲得性免疫反應而受到限制。因此，免疫抑制性的信號途徑的沉默將是DNA疫苗效能得到加強的一種極有潛力的策略。Huang等[37]應用在體生物發光技術所做的研究結果顯示，皮下注射編碼shRNA的DNA，可以作為體內基因沉默和一種能夠有效提高DNA疫苗效果的手段。

2．6標記于轉基因載體建立轉基因動物模型

2．6．1基因表達動物模型為研究目的基因是在何時、何種刺激下表達的，可將螢光素酶基因插入目的基因啟動子的下游，并穩定整合于實驗動物染色體中，形成轉基因動物模型。可用于研究動物發育過程中特定基因的時空表達情況，觀察藥物誘導特定基因表達及其他生物事件引起的相應基因表達或關閉。Chen等[37]將受胰島素調控啟動子調控表達螢光素酶的轉基因小鼠制成糖尿病小鼠模型，采用在體生物發光成像技術證實了肝臟組織中含有可生成胰島素的細胞。研究結果也證實了在轉錄調控序列和反式轉錄因子與目的基因相同的情況下，螢光素酶的表達水平及底物發光強度能夠真實反映目的基因的表達狀況。目前對于調控多藥耐藥性基因－1（mdr－1a）表達的關鍵因子和胞內微環境的機制尚不明了，使多藥耐藥性依然成為對癌癥患者成功化療的一大障礙。為深入研究mdr－1a在體內組織中轉錄調控的機制，Long等[38]通過胚胎干細胞同源重組、遺傳雜交的手段構建了基因型為mdr－1a＋／Fluc的轉基因小鼠（野生型基因型為mdr－1a＋／＋）。mdr－1a＋／Fluc中Fluc已完全置于mdr－1a開放讀碼框中，其表達受內源性mdr－1a啟動子及相應各種反式作用因子的調控，Western印跡等不同方法均驗證了該模型mdr－1a的表達量與Firefly螢光素酶蛋白表達、發光強度成正比。該小鼠體內Fluc的表達與mdr－1a的表達在時間、所處的微環境均完全一致，可作為研究各種因素下mdr－1a表達調控的理想的動物模型。類似的研究所建立的模型能彌補體外細胞培養不能提供的特定基因表達的真實微環境的缺點，也能彌補基因敲除小鼠存在的代償效應等不足[39]。

2．6．2各種疾病模型研究者根據研究目的，將致病基因、病毒及細菌進行螢光素酶標記，轉入動物體內形成所需的疾病模型，包括免疫系統疾病、感染疾病等。除可提供靶基因在體內的實時表達和對候選藥物的準確反應，還可以用來評估候選藥物和其他化合物的毒性，為藥物在疾病中的作用機制及效用提供研究方法。Hsieh[40－41]等將受前列腺特異性抗原啟動子調控表達螢光素酶轉基因小鼠（sPSA－Luc），與前列腺癌轉基因模型小鼠TRAMP雜交，經檢測篩選得到的子代小鼠TRAMP－Luc隨前列腺特異性抗原的表達穩定產生螢光素酶。因此，該小鼠借助在體生物發光成像技術已被成功地用于前列腺癌的發生及轉移研究。

3在體生物發光成像技術的發展趨勢

近年來針對生物發光成像過程的三大要素，即螢光素酶、底物、成像設備的研究不斷取得新進展。研究人員應用遺傳學手段，在基因、蛋白水平對各種螢光素酶的分子結構進行改造，獲得了新的螢光素酶，使底物發光的波長發生明顯的紅移（使發光波長變長）從而減少了光穿透機體組織時的光吸收，提高了螢光素酶在哺乳動物細胞中表達的穩定性，改變了酶在組織細胞中的半衰期。與原先的天然螢光素酶相比，通過改進得到的各種螢光素酶在體內表達的穩定性、催化底物的反應等方面得到了優化，不僅增加了發光輸出量，更能適應不同時程的成像方式[42－46]。各種螢光素酶與體內不同組織對應著獨特的動力學特征。研究人員試圖通過優化發光底物轉入體內的方式、底物在體內的釋放方式、對細胞內底物攝入相關蛋白加以限制，以及對底物本身的結構加以改造等手段，來滿足體內不同時程生物過程的動態性研究。Kheirolomoom等[47]分別用長循環脂質體和溫度敏感型脂質體包裹螢光素并轉入體內。前者螢光素酶以一定水平正常表達時發光完全依賴于體內螢光素的釋放。今后，通過選擇合適的包裹材料（如設計合理的脂質體）或其他運載方式（如植入性微滲透泵[48]），可能使底物在體內較長時間內保持相對恒定的釋放速率，使底物濃度保持穩定。#p#分頁標題#e#

這樣，發光強度在一定時間內完全取決于螢光素酶的表達水平。而溫度敏感型脂質體可以被直接運到腫瘤組織中，通過一次超聲熱處理，可以引發一次爆發式快速釋放，這種溫度敏感型脂質體則可以實現定點轉入和定點釋放底物。螢光素酶底物進入細胞的過程受細胞內某些自身蛋白的影響。Zhang等[49]發現ABC家族的乳腺癌耐性蛋白（ABCG2／BCRP）作為重要的膜轉運蛋白，其表達水平和特異結構域的功能影響螢光素的攝入過程，因而影響生物發光信號的產出。這就提示，一方面可通過降低或消除此類蛋白對底物進入靶細胞的影響，使發光信號相對地最大化，另一方面可被用于高效篩選針對ABCG2／BCRP的藥物抑制劑[50]。從某些細菌得到的螢光素酶基因均位于一個操縱子內，且操縱子內除含有螢光素酶基因外，還包含整套底物合成酶基因，因此，將該操縱子穩定轉入的細菌侵染動物模型后，無需外源底物就能實現成像[51]。若將這類細菌來源的螢光素酶應用于動物細胞，可能更有利于在體發光成像。但這是否可行，目前尚未見相關報道。成像設備方面的進展不僅提高了設備的靈敏度，而且使功能更加全面，數據采集與分析更加精確。例如，已經應用三維成像技術使信號定位更明確、分析更全面。隨著在體生物發光成像技術的逐步成熟，必將使其更廣泛地應用于生物醫學研究的各領域。