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本文作者：王占科 雷萬生 常津 單位：天津大學(xué)精密儀器與光電子工程學(xué)院生物醫(yī)學(xué)工程系 天津大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院納米生物技術(shù)研究所
生物芯片技術(shù)涉及分子生物學(xué)、生物材料學(xué)、微加工技術(shù)學(xué)、化學(xué)、物理、計算機(jī)等多學(xué)科和領(lǐng)域。它針對DNA、RNA、蛋白質(zhì)及其他生物分子,將不連續(xù)的、離散的分析過程集成在一起,完成樣品預(yù)處理、親和結(jié)合反應(yīng)以及信號檢測等過程,實現(xiàn)對成千上萬種生物分子的高通量檢測分析[1],在蛋白質(zhì)組學(xué)及基因組學(xué)科研、疾病診斷和預(yù)警、藥物或手術(shù)療效判斷以及新藥開發(fā)、司法鑒定和食品安全等領(lǐng)域,均有廣闊的應(yīng)用前景[2]。
1生物芯片分類
按生物芯片材料和支持物類型可分為固態(tài)生物芯片和液態(tài)生物芯片等。固態(tài)生物芯片按待測物質(zhì)種類,又可分為蛋白質(zhì)芯片和基因芯片。液態(tài)生物芯片技術(shù),又稱Luminex技術(shù)[3],是以微球表面為支持物,最早的微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片由美國Luminex公司生產(chǎn)開發(fā)。按生物芯片結(jié)構(gòu)和制作特征,可分為微點陣(陣列)生物芯片、微流路生物芯片和芯片實驗室(lab-on-a-chip)。按照生物芯片編碼原理可分為固態(tài)平面坐標(biāo)編碼生物芯片、微球顏色編碼液態(tài)生物芯片和微球阻抗編碼液態(tài)生物芯片。
2生物芯片研究現(xiàn)狀
2•1固態(tài)生物芯片研究現(xiàn)狀
固態(tài)生物芯片原理簡單,技術(shù)相對成熟,國內(nèi)外的研究主要集中在應(yīng)用領(lǐng)域的產(chǎn)品開發(fā)方面,并取得了一定的社會效益[2]。由中國博奧生物有限公司研發(fā)的多重等位基因特異性PCR通用芯片(allele-specificPCR-baseduni-versalarray,ASPUA),可在5h內(nèi)完成與遺傳性耳聾相關(guān)的4種基因的檢測[4]。美國Sandia國家實驗室正在利用微流控芯片研制生化戰(zhàn)劑檢測儀器,已進(jìn)入試驗階段[5]。
2•2液態(tài)生物芯片研究現(xiàn)狀
傳統(tǒng)液態(tài)生物芯片技術(shù)(微球熒光顏色編碼的液態(tài)生物芯片技術(shù))將流式技術(shù)、熒光顏色編碼微球、激光、數(shù)字信號處理和傳統(tǒng)化學(xué)技術(shù)融合在一起,獲得了“2005年國際臨床診斷技術(shù)革新大獎”。基于此項技術(shù)平臺的美國Luminex公司制造的Luminex系列產(chǎn)品和由荷蘭控股QIA-GEN跨國公司生產(chǎn)的BioRobotLiquichip系列產(chǎn)品,已經(jīng)通過該國的食品藥品管理局(FDA)認(rèn)證。隨著近年來全世界科學(xué)家的不斷深入研究,微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片技術(shù)性能越來越成熟,應(yīng)用范圍越來越廣[6-7],是國內(nèi)外研究的重點和熱點。2004年微球阻抗編碼液態(tài)生物芯片技術(shù)方法申請專利,2007年獲得中國發(fā)明專利[8],但其研究和開發(fā)目前幾乎是空白[9-10]。
3微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片
3•1微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片工作原理
微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片包括診斷芯片試劑盒和芯片檢測設(shè)備兩部分[11],其工作原理為不同熒光顏色微球編碼不同待測物質(zhì),不同熒光顏色的微球表面攜帶的探針熒光強(qiáng)度代表不同待測物質(zhì)的含量,通過顏色判讀和探針熒光強(qiáng)度檢測裝置以及軟件分析系統(tǒng),自動分析同一份樣品中的不同待測物質(zhì)含量。
3•2微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用
3•2•1抗原類物質(zhì)定量檢測各種微生物體、激素、腫瘤標(biāo)記物、細(xì)胞因子等都屬于抗原類物質(zhì),Bellisario等[12]用液相芯片技術(shù)對新生兒血游離甲狀腺素4(T4)和促甲狀腺素(TSH)同時進(jìn)行檢測,取得滿意效果。deJager等[13]基于液相芯片技術(shù),檢測刺激后的人類外周血單核細(xì)胞分泌的15種細(xì)胞因子,顯示與ELISA法有較好的相關(guān)性。
3•2•2抗體類物質(zhì)檢測檢測某些自身抗體對診斷自身免疫性疾病具有重要意義。Wong等[14]用液相芯片技術(shù)檢測人血清和腦積液中的抗西尼羅河病毒囊膜糖蛋白E的IgG和IgM抗體,血清和腦脊液用量明顯比ELISA法少,且測定速度明顯加快。Avaniss-Aghajani等[15]將液態(tài)生物芯片用于檢測984份標(biāo)本的抗SSA、SSB、Sm、RNP、Scl270、dsDNA和抗著絲粒蛋白B(centromereproteinB,CENP-B)抗體,結(jié)果顯示與免疫熒光技術(shù)(immunofluores-cenceassay,IFA)和ELISA技術(shù)具有可比性。
3•2•3核酸類物質(zhì)檢測檢測某種微生物特異的DNA或RNA,可以提示機(jī)體感染了某種微生物。此外,檢測機(jī)體某些基因(如SNP位點)改變以及這些基因的表達(dá)情況,可以對人體某種疾病進(jìn)行預(yù)警和診斷。Diaz等[16]設(shè)計了16種針對馬拉色菌不同種屬的特異性捕獲DNA探針,分別共價結(jié)合在16種熒光顏色微球上,制作液態(tài)生物芯片用于馬拉色菌屬的準(zhǔn)確鑒定。Lud等[17]將液態(tài)生物芯片技術(shù)用于不同分類癌癥的微小RNA(microRNA)表達(dá)譜檢測,結(jié)果表明在準(zhǔn)確性、抗交叉反應(yīng)性、線性范圍等方面均明顯優(yōu)于固相芯片。
3•3微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片的性能評價
微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片具有重復(fù)性好,線性范圍寬,高通量,速度快,靈敏度高,特異性強(qiáng),適用范圍廣,靈活性好等優(yōu)點,其缺點包括:①檢測人血清特異性抗體時,檢測背景信號過高;②檢測通量尚無法滿足臨床診斷和科研需要;③檢測設(shè)備技術(shù)要求高;④不同熒光顏色微球不能永久保存;⑤價格昂貴。
4微球阻抗編碼液態(tài)生物芯片原理及研究前景
微球阻抗編碼液態(tài)生物芯片的設(shè)計原理包括:①不同阻抗微球編碼不同待測物質(zhì);②不同阻抗表面熒光強(qiáng)度代表不同待測物質(zhì)的含量;③經(jīng)過反應(yīng)后的微球通過微球阻抗檢測(種類)和微球表面光信號強(qiáng)度檢測(定量)裝置,借助預(yù)存不同微球阻抗編碼與待測物質(zhì)的對應(yīng)關(guān)系以及已知濃度標(biāo)準(zhǔn)品與微球熒光強(qiáng)度的對應(yīng)關(guān)系,理論上可對成千上萬種(趨于無限多)的待測物質(zhì)進(jìn)行平行檢測。除了可以對微球的熒光色彩進(jìn)行編碼,還可對微球的其他特征進(jìn)行編碼。微球阻抗編碼技術(shù)因其原創(chuàng)性,已經(jīng)獲得中國知識產(chǎn)權(quán)保護(hù),微球阻抗編碼液態(tài)生物芯片在編碼原理、檢測通量、靈敏度以及檢測裝置性能等方面,理論上可能優(yōu)于微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片,但需要人們進(jìn)行不斷深入研究和開發(fā),并給予確證[10]。有多少種不同阻抗的微球,就能編碼多少種不同的待測物質(zhì)。微球從超導(dǎo)體到絕緣體,阻抗作為連續(xù)變量具有無限性,其大小信息理論上趨于無限多,這意味著微球阻抗編碼液態(tài)生物芯片檢測通量會遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于微球熒光顏色編碼液態(tài)生物芯片。隨著不同阻抗微球研制技術(shù)和檢測技術(shù)的不斷發(fā)展,無限制通量微球阻抗編碼將成為可能,從而為研究生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域以及蛋白質(zhì)組學(xué)涉及的成千上萬種蛋白質(zhì)提供超強(qiáng)大的檢測工具[10]。