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多壁碳納米管(MWCNT)是最為常用的一種人造納米材料，它所具有的特殊物理化學性質，使其在納米材料領域占據著重要地位。例如，出色的機械性能和機電性質使得它成為各種增強復合材料和智能材料的研究熱點［1-3］;極小的尺寸和高度對稱的結構賦予了它顯著的量子效應和電磁學性質;特殊的表面結構和孔結構讓它在吸附作用方面受到青睞，此外它還是光學和熱學領域研究的熱點［4］。然而，碳納米管的這些獨特理化性質也使得它具有特殊的生物效應。在進入生命體和環境以后，它們與生命體相互作用所產生的化學特性和生物活性與化學成分相同的常規物質有很大不同［5-7］。碳納米管可能產生新的污染，已成為世界各國政府和公眾關注的新焦點。   目前已有研究報道碳納米材料對微生物的毒性。Kang及其合作者研究發現［8］，碳納米管直接與細菌接觸，可導致細胞膜損傷，細胞代謝能力下降并引起核酸外泄。另一項研究表明［4］，單壁碳納米管(SWCNT)對革蘭氏陰性的埃希菌屬、假單胞菌屬以及革蘭氏陽性的枯草芽孢桿菌和葡萄球菌均能產生較大的細菌毒性，使細菌失活。而多壁碳納米管對不同菌屬細菌的毒性差異很大，總體毒性中等。這些研究的對象多為單一細菌，關于復雜的土壤生態環境中微生物的研究較少［9］。目前國際上僅有兩篇文章報道了碳納米材料對土壤微生物的生態毒理效應。Tong等通過測定土壤有機質、土壤呼吸作用、碳的礦化作用、氮循環和酶活性指標，發現富勒烯(nC60)對土壤微生物群落結構、功能和生物作用具有微弱影響［10］。Johasen及其合作者報道，在實驗條件下，富勒烯(nC60)對土壤的呼吸和微生物量沒有影響，但對快速生長的細菌具有抑制作用［11］。碳納米管對土壤微生物的影響，目前還缺乏認識。   土壤是陸地生態系統的主要組成部分，是珍貴的自然資源。土壤微生物是土壤中的活性組分，在維持土壤生態平衡如養分運轉、有機質分解和環境污染物凈化中發揮著重要作用［12］。為進一步揭示碳鈉米管的生態毒理效應，本研究以多壁碳納米管為研究對象，從生化作用、酶活性、微生物數量和群落結構等方面系統地評估了它對土壤微生物的影響，為碳鈉米管的環境風險提供理論依據。   1材料和方法(Materialsandmethods)   1.1儀器與試劑   儀器:7500FastReal-TimePCRSystem實時熒光定量PCR儀(AppliedBiosystems公司，美國)，TL-25/H基因擴增儀(BIOER公司，日本)，TanonEPS300電泳儀(上海天能科技有限公司)，HE120電泳槽(Tanon公司)，547R型臺式離心機(Eppendorf公司)，IngenyPho-rU突變分析系統(Ingeny公司，荷蘭)，透射電子顯微鏡(TecnaiF30，FEI公司，美國)和熱重分析儀(OQ50V20.6Build31，ThermalAnalysis公司，美國)。   試劑:多壁碳納米管(S-MWCNT-1020)購自深圳市納米港有限公司，外徑10～20nm，長度1～2μm，純度(重量百分比)95%～98%，無定型碳2%，灰分≤0.2wt%，比表面積40～300m2•g－1。圖1和圖2分別顯示了多壁碳納米管的熱重分析(TGA)和透射電子顯微鏡(TEM)分析結果。結果分析表明，多壁碳納米管的純度達到95%以上，平均管徑約為14nm，平均長度為1～2μm，與產品標注的性質相符。   1.2實驗材料   土壤樣品采自北京大學未名湖岸邊山坡地，用鑷子去除土壤中的草根及其他雜物，過2.5mm篩，篩過的土壤在室溫條件下留待使用。實驗用土壤pH為6.2，水解氮和速效磷的含量分別為67.4和20.2mg•kg－1，總有機碳含量為1.38%，含水量為4.86%。為避免水份揮發造成的誤差，實驗期間定期補水使土壤的含水率控制為5%左右，環境條件能夠保證土壤微生物的正常生命活動。   1.3實驗設置   設置兩組實驗，分別為碳納米管組和對照組。對于碳納米管組，按1mg碳納米管•g－1土的濃度將多壁碳納米管與土樣均勻混合，具體做法如下:將實驗用土置于有蓋大塑料盒內，在磁子攪拌的同時，從盒子上部的兩端通過插入的玻璃管用氮氣少量多次吹入所需量的多壁碳納米管，進行混勻。將混合均勻的含碳納米管的土樣分裝至18個250mL錐形瓶，每個瓶內約140g土樣。對照組中僅有土樣，無碳納米管。以28d為測定周期，每個周期分別從碳納米管組和對照組取3個錐形瓶中的土樣測定所研究的各項指標(即做3個平行樣)。實驗期間通過定期加水，控制土壤的含水率在5%左右。   1.4分析方法   1.4.1多壁碳納米管的性質測定   多壁碳納米管的純度用熱重分析法(TGA)測定，測定條件為:氮氣(N2)下以10℃•min－1速率升溫(室溫至950℃);表面特性采用透射電子顯微鏡(TEM)分析測定。   1.4.2土壤理化性質和酶活性的測定   土壤呼吸作用的測定(密閉靜置培養法)，土壤氨化作用的測定(土壤培養法)，土壤脫氫酶活性的測定(氯化三苯基四氮唑法)和土壤熒光素二乙酸酯酶活性的測定均參考文獻［13］進行。   1.4.3土壤微生物量的測定   采用最可然數(MPN)和適時定量聚合酶鏈反應(RT-PCR)兩種方法對土壤微生物進行測定。MPN法按照美國FDA細菌學分析手冊進行［14］，土壤稀釋倍數為10～108倍，每個濃度做3個平行，在LB培養基中培養2d后，在600nm波長下測定其濁度。土壤細菌總DNA的提取采用FastDNASpinKitforSoil試劑盒(Qbiogene，美國)，提取過程按照試劑盒產品說明書進行。采樣針對細菌16SrDNA的通用引物341F(5’-CCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-ATTACCGCGGCTGCTGG-3’)對樣品中的細菌DNA進行擴增。PCR反應體系為20μL，包括10μL預混液(SYBR?qPCRMix)，0.2μL341F引物，0.2μL518R引物，0.4μL模板DNA，9.2μL無菌水。PCR擴增程序如下:95℃預熱20s;循環:變性94℃3s，延伸60℃30s，循環數40。用含有細菌16SrDNA的質粒作標準樣品，其濃度范圍為0.08～50μg•mL－1，根據樣品反應的Ct值，通過標線計算出樣品中細菌16SrDNA的濃度。#p#分頁標題#e#   1.4.4土壤群落結構的分析   采用聚合酶鏈反應-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)法測定土壤細菌的群落結構。用帶GC夾的細菌16SrDNA通用引物GC341-357F(5’-CGC-CCGCCGCGCCCCGCGCCCGTCCCGCCGCCCCCGC-CCGCCTACGGGAGGCAGCAG-3’)和518R(5’-AT-TACCGCGGCTGCTGG-3’)對樣品中的細菌DNA進行擴增，采用降落PCR法。PCR反應體系為50μL，包括25μL預混液(PremixTaqTMVersion2.0)，0.5μLGC341-357F引物，0.5μL518R引物，1μL模板DNA，23μL無菌水。PCR擴增程序如下:94℃預熱5min;循環1:變性94℃1min，雜交65℃1min(每個循環降0.5℃)，延伸72℃1min，循環數20;循環2:變性94℃1min，雜交55℃1min，延伸72℃1min，循環數10，最后1次循環延伸72℃10min，然后4℃保存。升溫程序設置為2℃•s－1，降溫程序設置為－1.5℃•s－1，熱蓋。對樣品DNA擴增產物進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)，儀器采用IngenyPhorU突變分析系統。以聚丙烯酰胺為變性劑，梯度為40%～80%，取PCR產物40μL，加入8μLDGGE上樣緩沖液，混勻后進樣，100V電壓預電泳5min后，以70V恒壓、60℃恒溫，電泳16h以上。電泳結束后，將膠體浸入3LEB染液中，避光染色45min，換至清水中避光脫色20min后于凝膠成像系統觀察。所得圖像利用QuantityOne4.62進行分析，包括泳道/條帶識別和相似性分析。   1.5數據處理   用Excel2007軟件記錄數據和制作圖表，采用成對數據t檢驗方法比較不同組的數據差異。用Spss18統計軟件對數據進行處理。   2結果(Results)   2.1多壁碳納米管對土壤微生物生化作用的影響   2.1.1呼吸作用   土壤呼吸作用是衡量土壤中微生物活性的重要指標。在為期近5個月的實驗中，測定了不同時段碳納米管組和對照組中土壤微生物的呼吸作用，結果如圖3所示。實驗初期碳納米管組的微生物呼吸作用略受抑制，隨后基本與對照組相近，且隨時間變化不大。為排除系統誤差的影響，以對照組為基準，作出碳納米管組與對照組的呼吸強度比值(文中定義為呼吸作用相對強度值)隨時間的變化曲線。從圖中可以看出，實驗初期碳納米管組的呼吸作用受到抑制，隨后逐漸恢復(2個月后與對照組基本   2.1.2氨化作用   土壤氨化作用是生物界氮素環境的重要環節，對植物的生長具有重要意義。圖4顯示碳納米管組和對照組中土壤的氨化作用。實驗前2個月內，碳納米管組中土壤的氨化作用明顯強于對照組，隨后兩組之間的相對大小逐漸發生變化，實驗3個月后，碳納米管組中土壤的氨化作用低于對照組。從相對氨化作用強度(碳納米管組與對照組的氨化作用強度比值)看，實驗初期碳納米管增強了土壤的氨化作用，但后期土壤的氨化作用減弱。   2.2多壁碳納米管對土壤微生物酶的影響   2.2.1脫氫酶活性   土壤酶是參與土壤新陳代謝的重要物質，其中氧化還原酶系在土壤的物質和能量轉化中占有很重要的地位。脫氫酶屬于氧化還原酶系，它能從一些基質中析出氫而進行氧化作用。本研究中，碳納米管組和對照組中土壤的脫氫酶活性變化見圖5。實驗后第28天、112天和140天，碳納米管組中測得的脫氫酶活性均明顯低于對照組;但在第0天和84天，碳納米管組中的活性略高于對照組。從相對脫氫酶活性(碳納米管組與對照組的脫氫酶活性比值)看，實驗初期碳納米管抑制了土壤的脫氫酶活性，中期土壤的脫氫酶活性逐漸復原，后期土壤的脫氫酶活性又逐漸減弱。   2.2.2熒光素二乙酸酯酶活性   土壤中廣泛存在熒光素二乙酸(主要來源于土壤微生物細胞及部分植物殘體)，它可被土壤中許多酶，如蛋白酶、脂肪酶和酯酶等水解，發生酶促反應。因此，有學者提出用熒光素二乙酸酯酶活性來評價土壤微生物的總體活性［13］。本研究中，碳納米管組和對照組中土壤的熒光素二乙酸酯酶活性變化見圖6。整個實驗期間，碳納米管組中的熒光素二乙酸酯酶活性均低于對照組。從相對熒光素二乙酸酯酶活性(碳納米管組與對照組的熒光素二乙酸酯酶活性比值)看，實驗初期有些波動，隨后逐漸減弱。   2.3多壁碳納米管對土壤微生物量的影響   研究采用兩種方法分析土壤的微生物量，即基因分析法(定量熒光PCR)和最可然數法(MPN)。圖7顯示了基因分析法測定的微生物量結果(圖中縱坐標采用對數坐標，因此僅做出正誤差線)。實驗初期，碳納米管組和對照組的微生物量基本持平;第56天，碳納米管組的微生物量明顯高于對照組;第84和112天，碳納米管組的微生物量明顯低于對照組(由于實驗操作的失誤，沒有獲得第140天的微生物量數據)。MPN法測定的微生物量結果與定量熒光PCR法基本一致。土壤微生物量的分析是1次進行的，即實驗期間，每次取樣時冷凍保存一部分土壤，實驗結束后，對所有土壤樣品中的基因進行提取和分析。因此，沒有計算和分析相對微生物量。   2.4多壁碳納米管對土壤微生物群落結構的影響   研究采用PCR-DGGE方法分析土壤的微生物群落結構。圖8為實驗第0天至第140天12個樣本的DGGE圖譜。其中N表示碳納米管組，C表示對照組，0、28、56、84、112和140表示實驗的天數。為了更清楚地對條帶進行分析，使用QuantityOne軟件包，以樣品N0為標準做出了12個樣品的泳道識別圖，見圖9。泳道中的條帶粗細不一，對應其在DGGE膠上的密度大小不同。密度大，則條帶比較粗黑;密度小，則條帶比較細。圖9中顯示了15條最明顯的條帶，其中條帶5、9和15在每個樣品中均有出現，條帶1、3、7和10也出現在10個以上的樣本中，條帶1、2和10在大多數泳道中都比較粗。根據條帶對比的結果，利用戴斯系數Cs(Dicecoefficient)計算出各樣品的相似性，所得相似度最大的兩組為實驗開始和第56天的樣品(N0和C0、N56和C56的相似度分別為74.9%、79.7%)，其他時間兩組的微生物群落結構相似度較低(N28和C28、N84和C84、N112和C112、N140和C140的相似度分別為42.4%、55.6%、42.5%和41.3%)。#p#分頁標題#e#   3討論(Discussion)   3.1實驗土壤的影響   本研究土壤中多壁碳納米管的濃度參照文獻設定為1mg•g－1新鮮土［10］。多壁碳納米管的水溶解度很低，必須使用其他溶劑才能制成均勻溶液。例如，文獻中報道用四氫呋喃做溶劑可得到多壁碳納米管的均勻懸濁液，但懸濁液中的四氫呋喃本身對生物也具有一定的毒性［15］。為排除溶劑對土壤微生物的影響，本研究中不使用任何溶劑，而是直接將多壁碳納米管顆粒混入土壤。為使實驗土壤盡量均勻，將過2.5mm目篩的實驗用土分次置于有蓋大塑料盒內，用磁子連續攪拌土樣，同時從盒子上部兩側通過插入的玻璃管用氮氣分次吹入所需量的多壁碳納米管，然后將混有多壁碳納米管的土壤放入有蓋的圓筒內進行混勻，再將混勻的土樣進行分裝。盡管如此，由于土壤本身的不均勻性以及固相混合難均勻的特點，每個錐形瓶內的土樣會有所區別，有可能導致實驗測定波動較大，在一定程度上會影響對實驗結果的判斷。但是，綜合各項指標，實驗結果還是表現了一定的規律性。   3.2多壁碳納米管對土壤微生物的生態毒理效應   本研究選擇呼吸作用、氨化作用、脫氫酶、熒光素二乙酸酯酶、微生物數量和微生物基因多樣性為指標，從生化作用、酶活性、微生物量和群落結構4個方面反映多壁碳納米管對土壤微生物的毒性。結果顯示，在相同處理條件下，不同指標呈現不同的變化。其中，氨化作用和脫氫酶的變化規律有些相似，即暴露于多壁碳納米管后，初期微生物的氨化作用和脫氫作用略有增強。郭桂悅等［16］發現納米炭黑能促進腈綸廢水生化處理過程中氨化菌的生長，從而提高生物脫氮的效果，其原因可能是腈綸廢水中含有難降解的有機物等，這些物質會阻礙氨化作用的進行，而投加炭黑后一部分難降解有機物會被吸附，使氨化反應得以順利進行，促進微生物中氨化菌的生長。土壤中可能含有與腈綸廢水中類似的阻礙微生物氨化作用的物質，而多壁碳納米管的加入可能吸附了這些物質，從而使氨化作用增強;后期氨化作用的減弱則可能是土壤中營養物質的消耗或某些有毒降解產物的積累引起的。另外，土壤中可能存在某些可以降解多壁碳納米管的微生物，因而實驗初期脫氫酶活性增強，后期因營養缺乏或中間有毒產物的積累，脫氫酶活性又逐漸降低。熒光素二乙酸酶通常被用來評價土壤微生物的總體活性。本實驗中，碳納米管處理組中熒光素二乙酸酶活性在整個實驗期間均低于對照組，表明總體上碳納米管對土壤微生物的總酶(主要是水解酶)有一定的抑制作用。有研究發現［18］，在一定劑量下多壁碳納米管誘導了明顯的細胞凋亡，包括細胞核變性、核基質減少，染色質濃縮，出現月牙樣邊集，細胞漿中出現空泡等現象。Sayes等［19］進一步指出，碳納米材料的毒性效應可能是由于產生氧化脅迫或自由基，造成脂質過氧化損傷和膜結構破壞，細胞正常功能喪失，引起細胞的死亡或凋亡［20-21］。因此，本實驗中的碳納米管很可能對部分土壤微生物細胞產生了類似的作用，但由于各項生化指標的靈敏度不同，所以實驗結果的顯著程度也不同。   MPN法和定量熒光PCR測定微生物量的結果基本一致:除第56天碳納米管組微生物量高于對照組外，其余幾個時間點碳納米管組微生物量均低于對照組。第56天碳納米管組微生物量的增加可能與實驗初期土壤中某些菌(如氨化菌)的增加有關。MPN法操作相對復雜繁瑣，且實驗結果的準確性需要嚴格無菌操作保證，因此實驗過程中引入隨機誤差的可能性較大［22-23］，與熒光定量PCR法相比誤差較大，使得兩組的差值波動較大。DGGE圖譜的分析結果表明，實驗開始和第56天時，碳納米管組和對照組群落結構的相似度較大，但在其他時間相似度較小。土壤中的優勢菌(如圖9中的條帶1、3、5、7、9、10、15)在各組中的含量均較高，說明多壁碳納米管對這些優勢菌種沒有影響或影響很小，某些甚至可能利用多壁碳納米管進行代謝。Allen等［17］研究表明，碳納米管能被山葵過氧化酶(horseradishperoxidase，HRP)催化進行生物降解。HRP會與過氧化氫形成一個活性很高的中間體，然后在蛋白質的作用下進一步轉化為另一種化合物，而位于HRP催化位點處的碳納米管將會被這種化合物降解。研究者推測，這很可能是自然界降解碳納米管的一種途徑，其他過氧化酶(如myeloperoxidase，MPO)也許對碳納米管的氧化降解同樣有效。Kagan等進一步研究發現［24］，人體嗜中性白細胞髓過氧化物酶(hMPO)產生的活性自由基中間產物和次氯酸鹽可以催化碳納米管的生物降解，主要是通過hMPO的氨基酸與碳納米管表面的羥基的相互作用實現的，這種作用也被Kam和他的同事在實驗室所證實［25］。因此，土壤中很可能存在一些微生物所分泌出的能夠降解碳納米管的酶。   研究中采用成對數據t檢驗方法比較了碳鈉米管組和對照組的相應測定指標數據差異，除熒光素二乙酸酯酶活性外(碳鈉米管組在0.05水平上顯著低于對照組)，其他指標在兩組中在0.05水平上沒有表現出明顯的統計學意義上的差異。這可能與研究的時間跨度還不夠長，測定存在波動，或者各項指標的反應靈敏度不同有關。   綜上所述，我們認為土壤中不同微生物對多壁碳納米管的響應不同，土壤微生物有些功能可能受到多壁碳納米管的抑制，但有些功能卻可能被增強。多壁碳納米管的毒性效應是碳納米管本身物理化學特性與微生物生物特性綜合作用的結果。總體上，多壁碳納米管對土壤微生物表現了一定的毒性，使土壤中的酶活性降低、生物量減少以及群落結構發生變化。